一株不产“透明圈”解磷菌的初筛及其溶磷能力的初步测定

叶劲松+卫新来+郭梦瑶+江雅琪+戴佳秀

摘 要：该文以Ca3（PO4）2为唯一磷源，以固体平板上是否出现溶磷“透明圈”为指标来初筛解磷菌时，发现一株霉菌，平板上长势良好，未产生明显“透明圈”；经液体摇瓶培养，发现其具有较强的解磷能力，上清液中有效磷在第6天达到极值10.66mg/L，pH值从起始7.21下降到4.52。以“透明圈”作为解磷菌的初筛标准，可能会丢失部分解磷菌。

关键词：不产透明圈；解磷菌；初筛；溶磷能力

中图分类号 S154 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）23-0038-02

解磷菌是一类能够溶解土壤中难溶态磷素，释放出能够被植物吸收的有效磷的微生物[1]。和传统的化学磷肥相比，它具有改善土壤质量和结构，提高土壤中磷的有效利用率，节肥增产，对保持生态环境平衡具有重要意义等优点[2-4]，日益受到学者们的关注[5-8]。在初筛此类微生物时，常以磷酸钙为唯一磷源的选择性培养基，以在固体平板上是否出现透明的溶磷圈为指标，来判断其是否为解磷菌[7，9]。若有明显的透明圈，则初步认为是解磷菌，否则被丢弃。本研究小组在筛选过程中，发现有的菌株在固体平板上不产溶磷透明圈，但液体培养显示具有一定溶磷能力，研究结果对于解磷菌初筛方法的改进完善具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料 菌种：昆明山区土壤。初筛固体培养基和液体摇床发酵培养基：见文献[10]

1.2 方法 初筛方法：稀释涂布方法，28℃培养，3～5d。逐日观察，以平板上是否有溶磷圈出现，来初步判断其溶磷能力。液体发酵测定解磷能力方法：1mL霉菌孢子菌悬液（108个/mL），接入100mL液体培养基，另取灭活的霉菌孢子菌悬液作为对照。28℃，转速150r/min，培养10d。每48h取出，5 000r/min离心10min，取上清液测定有效磷含量和pH值。有效磷测定方法：钼锑抗比色法[11]；pH测定方法：pH酸度计。

3 结果与分析

一般来说，“透明圈”是初步判断一菌株是否具有溶磷能力的标准方法[12-13]。一直以来，本研究小组都是按照这个方法进行筛选的。在初筛平板上，会经常出现不产“透明圈”的菌落，多数菌落小，但是有一株霉菌，不产透明圈，却长势很旺。对于这看似奇特的现象，决定进一步研究，故纯化后进行液体摇床继续培养。

3.1 初筛 如图1所示，该青绿色霉菌在平板上长势旺盛。既然在磷酸钙为唯一磷源的培养基上长势良好，那么该菌肯定能从外界中摄取磷源满足自身生长需要，也就是说它应该具有溶磷能力，只是没显示出“透明圈”，于是继续对其研究。

3.2 无“透明圈”解磷圈的上清液pH变化 图2显示，初始日，霉菌和灭活霉菌的液体培养基pH在7.21左右。2d后两者pH值都开始下降，但霉菌pH值下降更快速，且接种霉菌的上清液的pH值在第6天下降到最低点4.52，这说明此株霉菌确实产酸；而与此同时灭活霉菌的上清液pH值，始终在6.8左右。

3.3 无“透明圈”溶磷圈上清液中有效磷变化 从图3可以看出，上清液中有效磷一直在快速上升，并在第6天达到最高点10.66mg/L。说明此霉菌确有溶磷能力，能将难溶磷酸三钙溶解，使得溶液中有效磷含量上升。本实验只是测定了上清液中的有效磷，若加上菌体内的磷素，实际总共溶解的有效磷将更可观[14-15]。在第6天之后有效磷含量下降，可能是随着时间推移，营养物质不断被消耗，使得其溶磷能力下降或部分溶磷菌死亡。前6d，有效磷变化趋势和pH变化趋势呈现负相关，即pH下降，有效磷上升。似乎是由于产酸，导致不溶磷酸钙溶解，释放出有效磷，这也和多数学者报道的溶磷机制相同[14，16]。此株溶磷霉菌，之所以在平板上没有明显的“透明圈”，原因可能是因为该菌产酸酸性不够强，导致溶磷透明圈不明显，或是由于生长旺盛的气生菌丝将很小的溶磷圈覆盖了，也可能尚存在其他原因。

4 结论与讨论

以“透明圈”判断菌落是否为解磷菌，可能会丢失部分解磷菌。平板“透明圈”方法只是进行溶磷微生物筛选的较为初步的方法，它并不能作为评判某微生物是否具有溶磷能力的绝对标准方法，测定液体有效磷才是准确测定其溶磷能力的可靠方法，因为不产“透明圈”的溶磷菌也极可能有较强的溶磷能力。如对平板上的所有微生物都进行液体摇床有效磷测定，工作量太大，而“透明圈”法简单快捷，却不完全可靠。如何解决这一对矛盾，今后仍需要作进一步的探讨研究。

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（责编：张宏民）