HBV相关性肝癌临床病理学特征与MFGE8表达的相关性*

唐秀丽 韩利峰 程秀莲 赵 娜

张家口市第一医院消化科 (河北 张家口， 075000)

肝癌是全球癌症相关死因中主要原因，我国肝癌的发病率及死亡率都占全球50%以上[1]。乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的慢性感染是肝癌的主要危险因素，其中HBV相关性肝癌占2/3以上。早期诊治该病能及时阻断病情的进展，从而促进改善患者的预后[2,3]。病理学活检为该病诊断的金标准，但是为有创性检查，而影像学诊断虽然有一定的敏感性，但是诊断特异性一直有待提高[4]。已有研究显示乙型肝炎发展到乙型肝炎相关性肝癌是一个多步骤、多因素、多阶段相互作用的复杂过程，涉及许多的基因与肿瘤标志物在不同节点的表达[5]。CEA、CA199等肿瘤标志物在一些恶性肿瘤的的诊断、病情判断以及疗效监测方面具有一定临床价值[6]。但由于HBV相关性肝癌在临床症状体征、发病机制方面存在显著个体差异，目前常规标志物种类虽多，检测的特异性、敏感度均不甚理想，还需要寻找更加可靠、准确的肿瘤标记物，从而完全满足临床诊断的需要[7]。乳脂肪球表皮生长因子8蛋白(MFGE8)作为一种分泌性糖蛋白，在巨噬细胞、内皮细胞、肌上皮细胞、树突状细胞等都有广泛分布，但MFGE8分泌量较低[8]。MFGE8在肿瘤组织中表达明显高于正常组织，其表达分布与病程长短密切相关，可能成为判断肿瘤患者预后的特异性指标，但是在肝癌中的应用还无相关报道。本文具体探讨了HBV相关性肝癌临床病理学特征与MFGE8表达的相关性，以明确HBV相关性肝癌的发生机制，促进早期检出该病。现总结报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究得到了医院伦理委员会的批准与所有入选患者的知情同意。选择2014年8月到2018年5月在张家口市第一医院消化科诊治的HBV相关性肝癌患者123例作为研究对象。纳入标准：无合并胆管细胞癌；经病理确诊为肝癌；首次发病；临床与随访资料完整；术前未接受介入、射频消融等任何有创性治疗；临床与病理资料完整。排除标准：合并HCV感染的患者；切缘阳性的患者；严重心、肾功能异常患者；临床与病理资料缺乏者。

123例患者年龄50～78岁，平均年龄(58.22±3.19)岁；平均病程(4.11±0.82)年；平均体重指数(21.47±1.27)kg/m2；临床分期：Ⅰ期65例，Ⅱ期35例，Ⅲ期23例；组织学分化：高分化67例，中分化42例，低分化14例；淋巴结转移45例；淋巴管癌栓44例。

1.2 免疫组化检测MFGE8表达 免疫组化试剂盒购自福建迈新生物技术开发有限公司，MFGE8兔抗人多克隆抗体(工作浓度1∶200)购于Abcam生物技术有限公司。PBS代替一抗作为阴性对照，用已知的MFGE8阳性的恶性肿瘤组织切片为阳性对照。

取所有患者的病灶组织标本与癌旁组织标本，病灶组织标本均取自患者手术标本中，癌旁组织经病理证实非肿瘤组织。存档组织标本蜡块应用组织阵列仪打孔取材，每块取两点，切片机连续切片，厚度3 μm，65℃烤片4 h。按照免疫组化检测试剂盒说明书所示步骤进行，切片经柠檬酸缓冲液高压抗原热修复预处理。取出抗原修复盒，待修复液自然冷却，PBS洗涤3次，把3% H2O2滴加在组织切片上，室温静置10 min；PBS洗涤3次，滴加正常山羊血清封闭液，室温10～15 min。滴加抗MFGE8抗体2 μl，置于湿盒内，4℃过夜。PBS洗涤3次，滴加复合二抗2 μl，室温静置20 min；PBS洗涤3次后DAB显色3～5 min；苏木精复染，脱水、透明、中性树胶封片，镜检。

MFGE8阳性为以胞浆或胞核中显示棕黄色颗粒，各选取5个高倍镜视野(×400)作阳性细胞计数，判断标准为阳性细胞数≤10%为阴性，>10%为阳性。

1.3 Western blot检测MFGE8蛋白表达 取肝癌组织组织，加入RIPA组织裂解液，对组织进行打碎处理通过匀浆器，时长为5 min的冰浴处理；13 000 r/min离心处理，时长为10 min，取上清，进行蛋白浓度定量检测后对蛋白进行稀释。后进行蛋白分离，腹膜，室温下进行封闭处理(TBST液，5%)，时长为2 h，后在对应1∶1 000一抗稀释液中孵育PVDF膜，第2日取出，TBST液洗涤，加入1∶10 000二抗，2 h孵育，加发光液DAB，凝胶成像仪记录灰度值，β-Actin为内参，计算目的蛋白相对表达。

1.4 调查资料 调查所有患者的一般资料，包括性别、年龄、体重指数、糖尿病史、高血压病史、病程、Child-Pugh分级、吸烟史、饮酒史等。记录所有患者的实验室检查结果数据，包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰氨基转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、肿瘤抗原199(CA199)等。患者的临床病理学特征指标包括临床分期、组织学分化、淋巴结转移、癌栓等。从术后病检确诊日期开始，到患者死亡或随访截止日期为止，随访截止日期为2019年5月31日。

1.5 统计学方法 在统计分析时应用的软件是SPSS 22.00，通过百分比以及均数±标准差来表示计量数据与计数数据，χ2检验和独立样本t检验来进行对比，相关性分析应用的是直线相关分析，多因素采用Logistic回归分析，检验水准α<0.05。

2 结果

2.1 临床特征 在123例患者中，Child-Pugh分级为A级73例，B级50例；糖尿病史32例、高血压病史25例、吸烟史54例、饮酒史43例。

入院隔日凌晨抽取患者空腹静脉血2～4 ml检测实验室指标：ALT(78.24±11.59)IU/L，AST(67.21±12.04)IU/L，GGT(118.03±22.71)IU/L，LDH(220.19±32.71)IU/L，ALP(132.19±34.19)U/L，AFP(872.71±128.29)μg/L，CEA(4.92±0.31)mg/L，CA(199 58.22±14.29)U/ml。

2.2 MFGE8表达比较 病灶组织的MFGE8表达阳性率为54.5%，显著高于癌旁组织的2.4%(P<0.05)。见图1。

图1 人肝癌组织与癌旁组织中MFGE8表达

2.3 MFGE8表达与临床病理特征的相关性 在123例患者中，不同年龄、吸烟史、组织学分化、临床分期、淋巴结转移、癌栓患者的MFGE8表达阳性率对比差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 患者一般资料、不同病理特征HBV相关性肝癌的MFGE8表达阳性率 (n)

2.4 相关性分析 直线相关分析显示患者的MFGE8表达与组织学分化、临床分期、淋巴结转移、癌栓、吸烟、AFP成显著相关性(P<0.05)。见表2。

2.5 预后情况 所有患者随访到2019年5月，平均随访时间(31.72±2.28)个月，123例患者中死亡65例，死亡率为52.85%。

表2 HBV相关性肝癌患者MFGE8表达与其他指标的相关性 (n=123)

2.6 影响因素分析 在123例患者中，以患者随访预后是否死亡作为因变量，进行二元Logistic回归分析。显示MFGE8、组织学分化、吸烟等为影响患者预后死亡的主要危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响HBV相关性肝癌患者预后死亡的因素 (n=123)

3 讨论

肝癌为临床上常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，预后差。HBV相关性肝癌是原发性肝癌中的一种最主要类型，所占比例在90%以上，在我国东南沿海地区高发，可发生于任何年龄段，其中以40～50岁为多见[9]。手术切除为HBV相关性肝癌最主要的治疗手段，同时也是患者有望长期生存获益最有效的措施。但是很多患者起病隐匿，早期缺乏典型症状，入院就诊时往往已处于中晚期，且肝功能差，伴有癌栓与淋巴结转移情况，使得根治性手术切除受到极大的限制，导致预后死亡率很高[10]。

在HBV相关性肝癌的检出与预测预后中，影像学检查应用比较多，但是能反映出的只是形态学变化及病变大小，与患者的病理特征无显著相关性[11]。AFP是肝脏疾病的特异检查，然而并不是HBV相关性肝癌的特异性指标，其对该病的检出具有一定帮助，但效果并不显著[12]。MFGE8是一种存在于多种物种乳汁脂肪小球表面的亲脂性糖蛋白，主要由胆固醇、磷脂、糖蛋白、蛋白脂构成，主要由分化的乳腺上皮细胞合成，然后经膜包被分泌人乳导管腔。MFGE8在乳腺癌细胞中发现MFGE8的分泌量显著提高，可通过辨认暴露于凋亡上皮细胞表面的丝氨酸与凋亡的上皮细胞结，从而加快对凋亡细胞的清除[13]。MFGE8在恶性肿瘤的高表达还可抑制轮状病毒促进凋亡上皮细胞的清除，从而促进肿瘤细胞的快速增殖与转移[14]。本研究显示病灶组织的MFGE8表达阳性率显著高于癌旁组织；不同组织学分化、临床分期、淋巴结转移、癌栓患者的MFGE8表达阳性率对比差异有统计学意义；直线相关分析显示患者的MFGE8表达与组织学分化、临床分期、淋巴结转移、癌栓、吸烟、AFP成显著相关性。从机制上分析，MFGE8可以通过调节NF-kB、P53等多种转录因子与DNA的结合能力，加快血管内皮生长因子的表达量，从而促进肿瘤细胞快速增长[15]。并且MFGE8可通过促使DNA前体合成、抑制由细胞黏附促发的应激信号等多种途径促进肿瘤细胞的增殖及生长[16]。

HBV相关性肝癌的恶性程度高、病情进展快、预后差，寻找有效的临床病理指标在判断该病患者的预后时具有重要价值[17]。本研究123例患者死亡率为52.85%；二元Logistic回归分析显示MFGE8、组织学分化、吸烟等为影响患者预后死亡的主要因素。从机制上分析，MFGE8的高表达通过结合肿瘤细胞膜上磷脂酰丝氨酸，促进细胞向前移动爬行，导致细胞的形态及骨架结构发生改变，从而加速细胞的侵袭，并且还通过增强对抗癌药物的耐药作用影响患者的预后[18]。并且MFGE8还可激活巨噬细胞和T淋巴细胞，改变胰岛素敏感性，导致胰岛素抵抗，促进恶性肿瘤细胞的增殖[19,20]。不过MFGE8在HBV相关性肝癌中的作用有一定的复杂性，在某种意义上从临床组织得到的病理标本无法真实反映出MFGE8的表达谱。再者限于患者数量少及收集标本时间较短的原因，本次研究只纳入了较少的病例，可能存在一定的研究偏倚，将在下一步进行深入分析。

总而言之，HBV相关性肝癌组织中MFGE8呈现高表达状况，与患者的临床病理特征显著相关，也是影响患者预后死亡的主要因素。