鸡尾酒抗体D2-40/CD34-CK双重免疫组化染色在淋巴结检出数量不足CRC标本脉管侵犯评估中的应用价值

凌志锋

广东省平远县人民医院病理科 514600

近年来，生活方式的改变导致国内外结直肠癌(CRC)发病率逐渐提升，而结直肠癌切除手术开展数量逐渐增多[1]。在手术中或手术后，病理科往往需要对标本展开病理检验，了解肿瘤病理分期情况，以此对患者病情进行准确评估[2-3]。为对患者疾病做出临床分期判断，对预后进行尽早评价，在获取CRC标本后，常规检查中，至少需要检出12枚淋巴结，才能对临床分期做出判断。然而，部分患者因年龄、化疗或肿瘤发生部位的影响，无法检出12枚淋巴结，此时对其进行分期存在一定困难[4]。脉管侵犯为恶性肿瘤远处转移、淋巴结转移的必要条件，因此采用有效方法判断有无脉管侵犯，对疾病判断有重要价值[5]。本文选取此类标本，以对照分析方式，探索鸡尾酒抗体D2-40/CD34-CK双重免疫组化染色在脉管侵犯评估中的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2011年3月—2013年12月手术切除且确诊的CRC患者标本，共116份，经检测淋巴结检出数量不足12枚，患者未合并其他恶性肿瘤，临床资料完整，可随访，年龄29～64岁，平均年龄(59.46±2.31)岁。

1.2 方法 将本组标本均一分为二，一份行常规HE染色，一份行双重免疫组化染色。双重免疫组化染色：对石蜡切片进行脱蜡并水化处理，用EDTA抗原对其行20min的热修复，阻断内源性过氧化物酶，10min左右。根据工作浓度，将兔抗CK、鼠抗D2-40及CD34混合，制为鸡尾酒抗体，也即即用型混合一抗，在37℃的盒子中，行60min孵育。用鼠抗—碱性磷酸酶、兔抗—过氧化物酶，根据一定比例进行混合，在室温中行20min孵育。用DAB试剂行15min显色处理，滴加AP-red试剂，行15min显色，用苏木精对其复染，以流水行15min冲洗，用75%乙醇对湿片组织烤干，用时10s，让其冷却到室温状态，以中性树胶对玻片进行加盖，封固。

1.3 判断标准 (1)D2-40/CD34检测显示胞浆及包膜着色为红色，判定是脉管；CK为胞浆着色为棕黄色，其中阳性区域含肿瘤细胞、癌旁正常上皮组织，来对脉管中癌栓加以判断。脉管侵犯：按照Delphi法来进行判断[6]，具体为：脉管围绕肿瘤细胞巢50%以上，即可判定为脉管侵犯。(2)对确定脉管侵犯的标本，进一步观察发生部位、癌细胞数量及侵犯程度，并对这些因素和患者生存期之间的关系进行分析。

2 结果

2.1 脉管侵犯评估效果 116份标本，经HE染色，显示脉管侵犯阳性24例，检出率20.69%；双重免疫组化染色显示脉管侵犯阳性48例，检出率41.38%；两种方法对脉管侵犯的检出率比较差异显著(χ2=11.600，P=0.001)。在HE染色判定为阳性的标本中，有3份标本经双重免疫组化染色判断为假阳性，实际是回缩裂隙。

2.2 双重免疫组化染色的进一步分析结果 经双重免疫组化染色判定为阳性的48份标本中，脉管侵犯的发生部位：壁内侵犯23份(47.92%)、壁外侵犯19份(39.58%)、壁内外侵犯6份(12.50%)，脉管侵犯程度：局部侵犯20份(41.67%)、中度侵犯19份(39.58%)、广泛侵犯9份(18.75%)；癌栓细胞数≥5.5 22份(45.83%)、<5.5 26份(54.17%)。可见脉管侵犯多数为壁内侵犯，以局部侵犯最为常见，癌栓细胞数<5.5的占比较高。

2.3 预后情况分析 经随访，双重免疫组化染色判定为阳性的48份标本中，患者平均生存时间为(52.36±4.18)个月；其余68份为阴性的标本中，患者平均生存时间为(82.77±6.94)个月；经对比，双重免疫组化染色判定为阳性的患者生存时间明显短于染色结果为阴性的患者(t=27.070，P=0.000)。

3 讨论

对于CRC患者而言，对其进行TNM分期判定是评估病情、分析预后的重要措施。要想进行临床分期判断，就必须对手术切除的标本进行病理检查，分析淋巴结转移情况，然而，部分标本检出的淋巴结数量较少，可能会导致N分期、淋巴结状态低诊断，这就导致淋巴结检出结果无法为术中及术后的病理判断提供依据[7-8]。另外，即使淋巴结转移检查结果为阳性，也可能由于淋巴结检查数量较少，导致分期判断偏低，或患者无进展生存期评估有偏倚。对于这部分患者，就需要另外寻找方法，判断患者病情，以便评估预后，提前为患者制定下一步的治疗计划[9]。

恶性肿瘤患者中，脉管侵犯是和淋巴结转移独立的危险因素，运用脉管侵犯评估也能在一定程度上掌握患者病情，解决淋巴结检出数量不足这一问题。在脉管侵犯情况的常规评估中，检验医师通常是借助HE染色，在光镜下查看，然而这一操作相对复杂，且不同病理医师获得的结论可能有所不同，易出现分歧，这是近年来临床亟须解决的问题。

免疫组化染色是病理检测的常用方法之一，操作简便，结果准确。本文中尝试运用鸡尾酒抗体D2-40/CD34-CK双重免疫组化染色法评估标本的脉管侵犯情况，该方法能准确区分脉管、裂隙，便于医师识别脉管中的癌栓，同时也可将一些微小癌栓检查出来[10]。在这一结果上获取的半定量数据，能够对脉管侵犯和预后之间的关联进行预测。因此，这一方法可以用作CRC患者淋巴结检出量不足时的补充诊断方法。本文中对116份标本实施HE染色和双重免疫组化染色，结果发现，双重免疫组化染色对脉管侵犯的检出率明显高于HE染色的检出率(P<0.05)，说明双重免疫组化染色在判断脉管侵犯中的效果更为明显。另外，双重免疫组化染色还能对侵犯情况进行进一步分析，如本组经双重免疫组化染色判定为阳性的48份标本中，脉管侵犯多数为壁内侵犯，以局部侵犯最为常见，癌栓细胞数<5.5的占比较高。对患者预后进行分析发现，双重免疫组化染色判定为阳性的患者生存时间明显短于染色结果为阴性的患者(P<0.05)，可见双重免疫组化染色结果能够反映CRC患者预后情况。

通过总结临床经验，笔者发现鸡尾酒抗体D2-40/CD34-CK双重免疫组化染色法具有如下优势：(1)和HE染色相比，该方法能在同一平面上对脉管和可疑癌栓组织间的关联予以呈现；同时，应用鸡尾酒抗体够节约检测时间，降低检测人员的工作量，成本较低，便于推广。(2)若CRC患者病变相对局限，应用鸡尾酒抗体进行检测，可节约标本，防止重复切片造成标本不足等问题出现。当然，该检测方法也存在一定不足，首先将D2-40、CD34联合应用时，在区分血管、淋巴管的过程中存在一定局限，医师对血道转移、淋巴道转移难以做出预测。另外，若脉管中癌细胞数量较少，应用这一方法进行分析，医师的判断仍具备一定主观性。总体来看，鸡尾酒抗体D2-40/CD34-CK双重免疫组化染色优势更突出。

综上所述，在淋巴结检出数量不足结直肠癌(CRC)标本脉管侵犯评估中，鸡尾酒抗体D2-40/CD34-CK双重免疫组化染色能够对脉管侵犯情况进行分析，同时可反映侵犯程度，对患者预后进行评估，值得推广。