脂肪与肥胖相关基因FTO对肝细胞增殖效果研究*

王 倩 折瑞莲 沙文琼 林湖滨 曹雨之

广东省深圳市人民医院 518020

机体健康与肝脏关系密切，肝脏疾病发病率逐年提高，严重影响人们的生活质量[1]。肝脏疾病发病不区分人群，如青少年肥胖、孕妇妊娠期脂肪肝[2-3]。一些常见的肝脏疾病由过度肥胖导致，如脂肪肝[4-5]。因此，探索与肥胖相关的因素显得尤为重要。

脂肪与肥胖相关基因(Fat mass and obesity-associated protein gene，FTO)于1999年在研究小鼠融合趾被发现，起初，认为与细胞程序性凋亡有关[6]。2007年，通过全基因组关联分析研究发现FTO是肥胖敏感性基因，与肥胖率、能量吸收率有关，编码m6A去甲基化酶[7]。2011年，FTO被鉴定为脂肪与肥胖相关基因，并与代谢性疾病、肿瘤发生发展存在密切关系[8-9]。在大鼠疾病模型研究中，发现FTO过表达导致体重显著增加、糖尿病等。FTO编码的去甲基化酶作用与代谢相关的信号通路分子，引起能量代谢失调，进而可能导致肥胖、糖尿病等代谢性疾病[10-11]。此外，有研究发现，脂肪组织细胞FTO表达水平改变会增加外周血细胞FTO等位基因高表达的风险[12]。在正常肝细胞中还不清楚其如何调控肝细胞的增殖活性。本研究旨在利用人肝正常细胞模型研究FTO如何调控肝细胞增殖，研究其干扰与过表达对肝细胞的增殖效果,以及对代谢相关基因表达的调控，以期合理指导肝脏疾病患者饮食，避免肥胖、糖尿病等代谢疾病。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂：1640培养基、甘油检测试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒、甘油三酯检测试剂盒与CCK-8试剂盒购自南京凯基公司。胎牛血清购自杭州四季青公司。FTO-OE过表达载体购自广州基旦生物公司。FTO-sh干扰载体购自广州艾基生物公司。qPCR反转录试剂盒与蛋白marker购自日本TAKARA公司。qPCR引物购自上海生工公司。GAPDH抗体购自美国CST公司。293T细胞与人肝正常细胞HL-7702购自中国科学院上海细胞库。SDS-PAGE凝胶试剂盒与蛋白裂解剂RIPA购自碧云天公司。Lipo2000转染试剂与TRIzol购自美国Invitrogen公司。

1.1.2 仪器:qPCR仪器(Bio-Rad，M400)。酶标仪(博璐腾，型号DC220)。超净台(苏州超净，型号WT-2ND)。二氧化碳培养箱(Thermo，型号BB150)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与转染：使用RPMI1640培养基添加终浓度10%的胎牛血清培养肝细胞，并置于37℃，含5%CO2培养箱培养细胞。293T细胞培养在6孔板， DNA(μg)(带有绿色荧光蛋白GFP标签)与Lipo2000(μl)的比例为1∶2。250μl Opti-MEM(不含血清和抗生素)稀释10μl Lipo2000，室温静置5min形成DNA-Lipo2000复合物。从6孔板中吸出500μl培养基，然后滴加入500μl质粒和脂质体混合物。4～6h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养基，继续将细胞放置温箱孵育。

1.2.2 CCK-8法检测细胞存活：细胞转染过表达及干扰慢病毒载体后，96孔板加入细胞 100μl/孔(约 1×104)，将96孔板在37℃，含5% CO2细胞培养箱中孵育1d、2d、3d、4d。向各孔中加入10μl的 CCK-8 检测溶液。37℃下孵育1h。读数前在摇床上轻微震荡混匀，使用酶标仪在 450nm 波长处检测每孔的吸光度。细胞增值率计算公式=(转染组/NC对照组)×100%

1.2.3 Western blot法检测蛋白表达：常规流程胰酶消化细胞，1 000r/min离心5min，转移至1.5ml离心管，PBS清洗细胞3次，按50μl RIPA+ 5μl PMSF (100mmol)比例加裂解液，吹打细胞，摇匀置于冰上30min。裂解完后，于4℃下16 000r/min离心15min。配制8%的SDS-PAGE，每孔上样20μg蛋白样品，恒压分离蛋白。切下目标条带以及内参条带。凝胶置于转膜液平20min，待处理。PVDF膜甲醇预处理3～5min，纯水洗膜2min，转至转膜缓冲液浸润5min。操作必须将气泡完全去除。按正负极方向放置转印夹。冰浴条件下，250mA恒流转移1h。取出杂交膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1h。一抗稀释浓度4℃过夜。TBST洗膜10min，3次。相应二抗稀释液37℃孵育1h。TBST(吐温-20，0.1%)洗膜10min，3次。将杂交膜置于干净的保鲜膜上。暗房显影，使用化学发光液均匀地加到膜的表面，并使反应持续5min。

1.2.4 qPCR法检测ATGL、c/EBPβ、FAS相对表达：胰酶消化并收获细胞，转入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。4℃离心，12 000g，15min，取上清。加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。4℃离心，12 000g，10min，弃上清。加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃离心，7 500g，5min，弃上清。室温晾干，加入DEPC 水溶解，超低温冰箱保存。反转录条件：37℃，15min；85℃，5s。qPCR体系：模板，1μl；前引物 (10μmol/L)，0.4μl，后引物(10μmol/L)，0.4μl；2×PerfecStar qPCR SuperMix，10μl；Nuclease free-Water，8.2μl。使用两步法分析基因表达，程序如下，95℃ 5s, 60℃ 5s, 然后42个循环扩增分析基因表达(95℃，15s；60℃，1min)。使用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达，以GAPDH表达为对照。

1.2.5 试剂盒方法检测甘油水平：甘油水平检测按照试剂盒说明书进行。细胞(包括分化的脂肪细胞)裂解，消化、离心收集细胞。或直接在培养皿内裂解。按比例每(1～2)×106细胞加100μl裂解液，混匀裂解。裂解物处理，取100～500μl裂解物转移到1.5ml离心管，进行下一步操作。70℃加热10min灭活脂肪酶，可能出现絮状沉淀。室温5 000r/min离心5min，上层清液既可用于酶学测定。工作溶液的配制，按R1∶R2=4∶1比例。标准品稀释，用蒸馏水、生理盐水或与样品缓冲液一致的液体，将4mmol甘油标准品倍比稀释为62.5、31.25、15.625、7.812 5μmol，注意设置0浓度对照反应管。甘油三酯水平检测方法同甘油检测。

2 结果

2.1 慢病毒干扰FTO-sh载体及过表达FTO-OE载体构建 FTO-OE慢病毒干扰载体(见图1a、b)及FTO-sh慢病毒过表达载体经转染293T细胞后(见图1c、d)，进一步培养细胞并分析FTO过表达及干扰效果。从图2可以看出，western blot分析看出，FTO-OE过表达载体有效提高FTO蛋白的表达水平(见图2a)，qPCR方法得到一致的结果(P<0.05)，见图2b。FTO-sh干扰载体显著性降低FTO蛋白的表达水平(见图2c)，qPCR结果亦显示出同样的结果(P<0.05)，见图2d。

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2.2 FTO对正常肝细胞的增殖效果 FTO-OE转染正常肝细胞HL-7702，培养5d。从图3a看出，肝细胞增殖率逐渐增强，与FTO-NC对照组存在显著差异，FTO基因对肝细胞生长有促进的功能(P<0.05)；当干扰FTO的表达时，肝细胞存活率存在明显的抑制水平，肝细胞的生长率逐渐降低(P<0.05)，见图3b。从以上结果可以看出，FTO具有促进肝细胞增殖功能。

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2.3 FTO调控肝细胞甘油代谢 当FTO过表达时，与FTO-NC对照组相比，肝细胞产生的甘油水平显著提高(P<0.05)，见图4a；当干扰FTO的表达时，与FTO-NC对照组相比，甘油的水平存在降低的现象(P<0.05)，见图4b。从实验结果能够看出，FTO对肝细胞里的甘油具有明显的正调控性。

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2.4 FTO调控肝细胞甘油三酯代谢 以上结果显示FTO对肝细胞甘油代谢调控具有正调控功能，那么其对甘油三酯应该也具有同样调控效果。与预期中的结果一致，实验结果显示，与FTO-NC对照组相比，当FTO过表达时，甘油三酯的水平显著提高(P<0.05)，见图5a；当沉默FTO的表达，甘油三酯的水平显著降低(P<0.05)，见图5b。与FTO对甘油代谢调控一致，FTO对甘油三酯代谢具有同样效果。

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2.5 FTO调控肝细胞与代谢相关的基因 以上结果显示，FTO对肝细胞脂肪代谢具有正调控功能。下面从基因的角度分析FTO对脂肪代谢相关基因表达调控。与FTO-NC对照组相比，当FTO过表达，ATGL表达水平降低， c/EBPβ与FAS表达水平提高(P<0.05)，见图6a；当干扰FTO的表达，出现相反的结果，ATGL表达水平提高， c/EBPβ与FAS表达水平降低(P<0.05)，见图6b。结果显示，FTO对脂肪代谢相关基因表达具有调控的功能。

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3 讨论

FTO是脂肪与肥胖相关基因，在脂肪代谢、肥胖、糖尿病、肿瘤进展等方面具有重要的调控功能[12-13]。本研究综合利用MTT方法、western blot、qPCR等方法发现，FTO对肝细胞增殖、甘油水平、甘油三酯水平、甘油代谢相关基因表达具有调控的功能。当FTO过表达，肝细胞增殖活性提高，甘油与甘油三酯水平提高，ATGL表达水平降低， c/EBPβ与FAS表达水平提高；当干扰FTO表达，出现相反的结果。FTO具体如何调控肝细胞脂肪代谢基因还需进一步研究。

代谢性疾病作为一种特殊的疾病，参与多种并发症发生发展。FTO与代谢性疾病关系密切，如脂肪肝、糖尿病、肥胖、肿瘤等[6,14-15]，其编码m6A去甲基化酶，介导多种疾病的发生发展，但是其对宿主细胞的代谢调控机制仍未阐明[6]。目前，多数研究表明FTO通过m6A修饰对葡萄糖和脂肪代谢发挥作用，在肝脏 FTO通过调节肝脏糖生成基因的表达参与调节全身糖稳态，如有小鼠研究表明，肝脏细胞特异性 FTO 过表达导致小鼠空腹血糖和胰岛素水平升高，糖耐量降低[16]。在肝脏组织细胞，FTO 通过改变肝脏中 m6A 的修饰状态和脂质代谢相关基因的表达进而调节脂质代谢，抑制机体能量转换为热量，最终形成肥胖[7,17]。有研究表明，FTO 通过下调靶基因的m6A 水平，降低线粒体含量，提高甘油三酯积累水平，促进脂肪在肝脏的积累，加剧脂肪肝进程。如脂肪肝大鼠模型中发现，FTO mRNA和蛋白水平显著上升，且发现FTO表达水平与丙二醛、超氧化物歧化酶浓度呈正相关，肝脏中FTO 水平升高与氧化应激和脂质沉积有关[18]。

然而，蹊跷的是FTO在不同的细胞疾病模型中出现的效果可能相反，因此阐明FTO在具体细胞中的作用很关键，如FTO与肪肝代谢性疾病形成的关系是怎样的，这对指导脂肪肝、糖尿病等患者尤为重要。