食油假单胞菌ZJ03利用甘油合成生物材料PHA研究

赵小慧，王明臻，胡风庆*

(1.辽宁省经济作物研究所，辽宁 辽阳 111000；2.辽宁大学 轻型产业学院，辽宁 沈阳 110036)

0 引言

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanonate，PHA)是一种自然界存在的高分子材料，具有优良的热塑性、生物可降解性、生物相容性等性能[1-3].PHA在可降解包装材料、医药缓释材料、手性单体、组织工程材料、生物能源等方面有广泛的应用前景[4-7].但PHA生产成本高、产量低，还不能满足各方面需求.PHA生产主要通过微生物发酵，已知300多种菌可合成PHA[8-9]，但仅有少数几种可商业生产PHA.对于PHA合成，菌种和培养条件是2个重要影响因素[10]，优良菌种可提高生产效率、降低成本[11]，培养条件之一的碳源占合成PHA成本的28%～50%，是制约PHA生产应用的瓶颈[12].不同碳源，可合成不同单体组成的PHA[13-14].利用混合碳源，能在一定程度上提高PHA产量，且可通过调整碳源比例获得不同单体组成PHA，从而改变PHA理化性能，扩大PHA应用范围[15-16].

生物柴油是解决日益紧缺能源问题的可行途径，然而，在制备生物柴油过程中，会产生以甘油为主的大量副产物，造成环境污染[17-18].为促进生物柴油产业可持续发展，避免环境污染，研究者探索利用副产物甘油合成PHA.但微生物菌株对高浓度甘油耐受性较差，多数情况下，菌株在高浓度甘油条件下无法合成PHA，更不能直接利用生物柴油副产物合成PHA[15-16，19-20].评估、筛选耐甘油PHA合成菌，优化PHA生产条件，具有非常重要的理论和实际意义.

本研究以可合成PHA的食油假单胞菌(Pseudomonasoleovorans)ZJ03和ZJ166，起皱假单胞菌(Pseudomonas.corrugata)CY06为出发菌株，评估筛选对甘油具有良好耐受性能的优势菌株，并优化菌株利用甘油合成PHA条件.

1 材料与方法

1.1 实验材料

食油假单胞菌(P.oleovorans)ZJ03和ZJ166，起皱假单胞菌(P.corrugata)CY06.

1.2 主要实验试剂与仪器

硫酸铵、甘油，沈阳禹王试剂公司；硫酸镁，天津市博迪化工有限公司(AR).

DL-6M大容量冰冻离心机购自长沙湘仪离心机仪器有限公司；Agilent 7890A气相色谱仪购自美国Agilent.

1.3 常用培养基的配置

LB培养基、发酵培养基(矿物盐培养基)：实验中采用体积比将甘油添加到所配置培养基中，甘油含量以百分数表示[21].

1.4 方法

1.4.1 菌体培养

无菌条件下，实验挑取LB平板上的菌株单菌落接种至LB液体培养基中，30 ℃培养8～12 h，制成种子液.5%接种至甘油含量分别为1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%发酵培养基中，30 ℃，200 rpm培养72 h.

1.4.2 菌体干重

实验将培养液8 000 rpm离心10 min收集菌体，分别用蒸馏水和95%乙醇洗菌体各1次，8 000 rpm离心10 min收集菌体，菌体称重，冷冻干燥备用.

1.4.3 PHA含量测定及计算

实验采用气相色谱法测定PHA含量，按文献[21]方法进行.

标样质量=10 mg

2 结果

2.1 菌体干重

实验测定P.oleovoransZJ03和ZJ166以及P.corrugataCY06在不同甘油含量下菌体干重(图1).结果表明，ZJ03在甘油含量1%～5%时菌体干重随甘油含量增加，5%～7%和9%～15%甘油含量时，菌体干重无明显变化，9%时，菌体干重随甘油含量增加而减少，在5%时最大，最大细胞干重为2.34 g/L.ZJ166在甘油含量为1%～3%时菌体干重下降，1%～9%时，菌体干重整体呈现上升趋势，只在7%时，菌体干重减少，在甘油含量超过9%时，菌体干重下降.CY06菌体干重整体随甘油含量增加而下降，在甘油含量为1%～5%时，菌体干重下降较快，而在甘油含量超过5%后，菌体干重变化不大.由此可见，在甘油含量较低时，3种菌株受影响较小，而在甘油含量大于7%后，ZJ03和CY06生长受到抑制，ZJ166菌株生长基本不受甘油含量影响，在较高含量也能很好生长，耐受甘油能力较强.

2.2 PHA含量

实验将冷冻干燥菌体进行酯化处理之后，利用气相色谱法测定菌体PHA，评估3种菌株的PHA合成能力(图2).

图1 3种假单胞菌在不同甘油含量下菌体干重

图2 3种假单胞菌在不同甘油含量下PHA含量

结果表明，ZJ03在甘油含量为1%～9%时，PHA合成能力较高，在大于9%后，PHA合成能力急剧下降，维持在极低水平，在3%时达最高，PHA含量(质量分数)为29.7%，在甘油含量为9%时，仍然能产生含量为23%的PHA.ZJ166无论在何种甘油含量下，PHA合成能力一直维持在极低水平上，PHA合成能力都较差.CY06在1%～3%的甘油含量时，PHA合成能力上升，3%～7%时，合成能力下降，在甘油含量大于7%后，PHA合成能力一直维持在较低水平.由此可见，ZJ03利用甘油合成PHA能力最强.

3 讨论

根据菌体干重可知，3种菌株在不同甘油含量下生长状况表现不同，表明耐受甘油能力不同.ZJ03和CY06在较高甘油含量下，生长均受到限制.ZJ166干重与甘油含量无明显相关性，基本不受甘油含量影响.ZJ03的PHA合成能力明显高于另2株菌.

菌体生长情况和PHA合成能力呈现一种偶联关系.ZJ03的甘油耐受性较好，且该菌株利用甘油合成PHA能力最强，甘油含量1%～5%为该菌株合成PHA适宜浓度.随着甘油含量增加，由于渗透压作用，菌体生长受到抑制，导致细胞酶活性降低，PHA产量下降，还导致菌体生长速度减慢，细胞干重下降.这与文献报道结果一致[15].

本研究结果表明，ZJ03能够利用甘油合成PHA，这为解决生物柴油副产物带来的环境污染拓展了新的解决方法.利用假单胞菌以甘油为原料生产PHA，不仅可降低环境污染风险，还可有效降低PHA生产成本，可有效促进可降解、可再生PHA的广泛应用，为从根本上解决传统塑料“白色污染”问题奠定基础.