结肠慢传输型便秘动物模型研究进展

文靖，周宇，李胜杰，李沛东，薛源，张广军

(1.川北医学院附属医院胃肠外二科，四川 南充 637000； 2.川北医学院，四川 南充 637000；3.川北医学院肝胆胰肠病研究所，四川 南充 637000)

结肠慢传输型便秘(slow transit constipation，STC)系以结肠功能失调、传导异常导致的肠道运输能力减弱为特征的顽固性便秘，主要临床表现为排便次数减少、排便困难、粪便干结、腹胀，甚至可引起一系列严重并发症，严重影响人们的生活质量[1]。当今社会，随着人们生活节奏的加快、饮食结构及习惯的改变，加之社会及生理因素的影响，STC的发生率逐年增加[2]。STC是功能性便秘的常见类型，占功能性便秘的10.3%～45.5%[3]。近年来，对于STC的发病原因及机制研究逐渐增多，包括脑肠肽、肠道菌群、Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICC)、精神因素等异常。它是一个多病因机制参与的病理过程，故对于其治疗方案尚未统一，临床首选药物保守治疗及良好生活习惯的转变；内科治疗效果不佳时，需积极行肠段切除吻合、回肠造口等外科手术治疗，但手术治疗常会引起便秘复发、腹泻、梗阻等严重并发症[4]。当前，仍没有理想的方法来有效治疗难治性STC，迫切需要新的疗法来加速结肠转运及康复[5]。而进一步的科学实验常以动物模型为研究基础，故需要设计与构建合理的实验动物模型，以期更好地复制动物STC模型。现就STC动物模型的研究进展予以综述。

1 实验动物的选择

目前，国内外便秘相关动物实验仍主要以小鼠、大鼠作为实验对象，也有越来越多的学者利用犬、兔、猪等大动物建立STC动物模型，以满足相应的实验需求。其中，大鼠作为制备便秘模型的常用实验动物，具有很多优点，如操作简便、耐受及抵抗能力较小鼠强、易获得、繁殖能力强，解剖结构和生理特点与人类相似等；小鼠亦有价格低廉、来源广泛，品系纯等优点，但小鼠耐受及抵抗力较大鼠差，不适合长期灌胃给药造模，因此小鼠在STC造模应用中受到一定程度的限制[6]。小鼠因体型较小，肠道较短，更适合观察排便实验；大鼠因肠道较长，产生的粪便相对更多，更利于肠道水吸收相关实验，而小鼠、大鼠均可以用于胃肠运动实验[7]。有研究表明，慢传输型便秘的发病机制可能与孕酮或雌激素有关[8-9]，为避免孕酮或雌激素的干扰，故在鼠类性别选择上以雄性鼠类为宜。

近年来，随着研究的深入出现多种STC治疗手段，如胃结肠电刺激、神经刺激、针灸治疗、外科手术等，由于这些操作复杂，需要使用STC大动物模型进行实验研究[10]。有学者在研究结肠电刺激对STC动物模型排便及胃肠传输功能影响时，采取犬为研究对象，因其与人的消化系统性质类似且体积较大，故可以使用与人体基本相同的仪器设备进行研究，以利于电刺激在人体的应用、刺激器的升级开发及人体适宜的模式和参数的选择[11]。王欣月[12]选用成年的普通级健康家兔(2.5～3.5 kg)，采用复方地芬诺酯混悬液经口灌胃的方法成功制作了便秘模型。Zhu等[13]通过制作猪STC模型对胃肠道电刺激系统进行了相关研究。

2 动物模型的构建

目前，STC动物模型的经典造模方法包括药物(复方地芬诺酯、洛哌丁胺、阿片类药物、大黄、酚酞等)造模法、物理刺激(活性炭冰水灌胃、限水限食等)造模法、药物联合低纤维饮食等[14]。随着研究者对STC研究的不断深入及经典造模方法的不断改进，逐渐出现了一系列新的造模方法，如通过诱导肠道菌群紊乱建立便秘模型、牛奶造模、通过化学消融法建立STC大鼠模型等。现对不同造模方法介绍如下。

2.1复方地芬诺酯造模法 复方地芬诺酯片是临床常见的一种止泻药物，含盐酸地芬诺酯及硫酸阿托品两种组分。其中地芬诺酯属于哌替啶类药物，能作用于结肠平滑肌，可通过抑制结肠黏膜感受器消除结肠黏膜局部的蠕动反射，从而减弱结肠运动功能，同时还可增加结肠的节段性收缩，明显延长结肠内容物通过时间,增加结肠内水分的吸收，使大便干结[15]。阿托品是肠道M型受体阻断剂，其与肠道M型受体结合后可抑制肠道平滑肌收缩，导致肠蠕动减慢及粪便干燥。顾志坚等[16]用复方地芬诺酯片[15 mg/(kg·d)]给大鼠灌胃2周，最终大鼠出现了24 h粪便数量减少、粪便重量减轻，成功建立了大鼠STC模型，该模型具有良好的操作性及可重复性，可在一定程度上避免停用建模药物后便秘恢复情况，造模周期较短，是一种相对简便的STC模型。

2.2洛哌丁胺造模法 STC动物模型多依赖化学药物影响胃肠传输，洛哌丁胺与复方地芬诺酯药理作用类似，也是国内外STC研究中常用的一种建模药物。洛哌丁胺可抑制肠道平滑肌的收缩，减少肠蠕动，延长肠内容物排出时间，促进水的重吸收，无中枢抑制作用且药物基本上不进入血液循环，安全性较高，故较为常用[17]。Deng等[18]采用5.0 mg/kg盐酸洛哌丁胺每日2次连续腹腔内注射5 d，制造了相对稳定的STC大鼠模型。Chen等[19]于每天9:00给小鼠喂食洛哌丁胺(10 mg/kg)，持续4周，成功诱导小鼠便秘。

2.3阿片类药物造模法 目前阿片类药物诱导便秘的具体机制尚不清楚，可能为μ阿片受体在整个胃肠道中均普遍表达，阿片类药物与之结合后会减少肠神经系统神经递质的释放，从而减弱肠道的动力、减少肠液的分泌，并增加肠液的重吸收，从而诱导STC形成[20]。许海尘等[21]给予小鼠每天皮下注射盐酸吗啡(2.5 mg/kg)，共持续45 d，结果显示小鼠 24 h粪便重量减轻减少、肠道蠕动减弱、c-kit阳性细胞数量减少，并推测其诱导STC的机制与内源性阿片肽增多或肠道ICC异常改变有关。由于吗啡类属于管制性药物且造模周期较长，这种造模方法并不常用。

2.4低纤维饮食联合药物造模法 诱发慢性功能性便秘的原因很多，饮食中缺乏膳食纤维、水分不足是产生便秘的重要影响因素[22]。其中膳食纤维可以充当肠道内的保水固体，缺乏膳食纤维可导致粪便排泄不畅，并储存在结肠，诱发便秘[23]。李雪等[24]单纯利用玉米、奶酪、蔗糖、糊精、植物油等低纤维饮食以不同比例混合饲养大鼠2个多月，建立了STC大鼠模型。低纤维饮食造模的优点为低纤维便秘动物模型可以很好地模拟非病理性因素及不良饮食习惯引起的便秘，不仅可避免化学药物便秘模型中药物所产生的不良反应，而且对高膳食纤维配方产品的通便疗效评价更为合理恰当[23]。但单纯低纤维饮食造模存在时间长、肠道功能易恢复等缺点，有学者推荐低纤维饮食联合药物造模。朱丹等[10]给予犬喂食罐头肉以及苯乙氧基化物和盐酸阿洛司琼，持续5周，成功建立了符合临床症状和病理变化的STC犬模型，可用于观察和评价电刺激和手术等治疗效果。

2.5诱导肠道菌群紊乱造模法 既往有研究表明，STC的发生与肠道菌群失调有密切关系[25]。在此基础上，胡琴[26]利用浓度为 62.5 mg/ml的克拉霉素、阿莫西林等抗生素混合液持续小鼠灌胃4 d，后予以125 mg/ml的抗生素混合液继续灌胃3 d的方法来诱导小鼠肠道菌群紊乱，从而成功建立了肠道菌群紊乱型便秘小鼠模型。黄璐[27]选用C57BL/6小鼠作为造模对象，首先用广谱抗生素清除小鼠体内的原有肠道微生物，构建“伪无菌鼠”模型，再将STC患者的粪便菌群移植到“伪无菌鼠”模型中，最后观察发现菌群移植后小鼠的症状与STC的临床症状相似。通过诱导肠道菌群紊乱建立的STC动物模型常用于肠道菌群对STC影响的研究及相关药物药效评价等；此种造模方法虽然较简单且造模周期较短，但模型易受环境、食物等影响，易恢复、不稳定。

2.6牛奶造模法 牛奶中的蛋白质及脂肪等主要组成成分可促进促胰液素、抑胃肽等的分泌，同时抑制胃肠运动，所以过多饮用牛奶易导致便秘[28]。蔡云清等[29]进行多因素分析发现，牛奶可能会增加老年人慢性便秘的发生风险。同时，张文仁[7]提出了利用70%的牛奶连续饲养小鼠7 d的牛奶造模法，其造模原理可能为小鼠过量摄入蛋白，造成肠道负荷过重或蛋白质代谢后产生大量碱性物质，从而打破肠道酸碱平衡，引起便秘。该造模方法虽然具有操作简单、造模周期短等优点，但目前应用较少，非常规造模方法，需要进一步的探究与验证。

2.7化学消融造模法 STC的病理机制与肠神经系统的关系成为当前的研究热点。马春星等[30]选用SD雌性大鼠在麻醉下进行腹腔手术，分别用不同浓度的苯扎氯铵溶液处理全结肠30 min，术后2周观察大鼠相关结肠动力学指标；结果发现实验组结肠运输时间明显延长，且与苯扎氯铵浓度呈正相关。相关机制可能为化学药物苯扎氯铵对结肠神经细胞进行破坏、消融，从而影响多种肠神经递质的合成与分泌，如一氧化氮(nitric oxide，NO)、P物质、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)，最终导致结肠传输功能减弱及便秘。此种造模方法虽然操作过程较复杂，但模型效果较稳定，有利于STC与肠神经系统关系的深入研究。

3 STC动物模型评价

3.1一般情况观察 一般情况观察是指对动物的活动量、精神情况、毛色、大便数量及质地等情况进行观察记录。有研究发现，STC模型组动物最初有腹胀状态，后逐渐出现倦怠，活动量显著减少，毛发蓬松无光泽，好蜷缩于饲养笼一端，反应缓慢，抓取时抵抗减弱，食欲减弱，大便黑、短小且干燥，排便次数减少，体重明显减轻，造模后期STC模型组动物明显瘦弱，触之觉皮毛松弛，无肉；造模恢复后，STC模型组动物各项表现逐渐恢复正常[31]。

3.2胃肠道传输功能检测 胃肠道传输功能检测通常包括首粒大便排出时间、24 h粪便数量及粪水含量、肠道推进率。受到动物肠道内粪便量及胃内食物残留量的影响，首粒大便排出时间并不一定能精确地反映胃肠道的传输情况；这时可利用酚红、活性炭等有色且不易被消化的物质灌胃，评估胃肠的运动[14]。首粒大便排出时间明显延迟是造模成功的重要评价指标之一。首粒大便排出时间受到个体差异、内外环境的影响而出现误差，所以通常会收集STC动物模型24 h甚至更长时间的大便来进行统计分析。STC伴粪便干结，故粪水含量也成为造模成功与否的常规评价指标之一。采集大鼠新鲜粪便，先称粪便的湿重，将其烘干后称粪便的干重，粪便含水率=(湿重-干重)/湿重×100%[32]。造模成功后，模型组会出现24 h粪便数量减少及粪水含量降低。将小鼠解剖后，在无张力状态下测量肠道全长(L1)和有色物质在肠道的推进距离(L2)，则肠道推进率(D)=L2/L1×100%[33]。肠道推进率反映了肠道传输能力，STC模型组的推进率低于正常组时，说明造模有效。

3.3ICC及c-kit的检测 肠道中ICC数量减少和结构异常会影响结肠蠕动功能，从而引起便秘的发生[34]。c-kit蛋白分子是ICC最重要的识别标记，它会影响ICC的功能[35]。通过蛋白免疫组织化学分析发现，STC模型组小鼠的结肠ICC基膜在结肠壁上溶解，ICC与其周围细胞之间的连接结构被破坏，ICC细胞核呈不同程度固缩，且ICC数量和c-kit阳性细胞较正常对照组显著减少[36]。通过免疫荧光技术及透射电镜检测分析发现，STC模型大鼠肠道内ICC数量可能由于钙离子介导的自噬而显著减少，虽形成网络状，但能观察到ICC密度变得稀薄，细胞形状窄而细[37]。

3.4在体结肠肌电测定 结肠平滑肌动作电位(亦称快波)是促进结肠运动前进的主要动力，而动作电位产生于慢波之上，慢波控制结肠平滑肌收缩节律、方向等，因此可以借助电生理技术分析检测STC动物模型的结肠慢波频率及振幅，从而评估结肠的运动传输功能[14]。有研究表明，正常大鼠结肠慢波表现为近似正弦波样曲线，振幅较整齐，而STC大鼠结肠慢波频率较正常大鼠明显减慢，频率变异系数增大，振幅明显增加，振幅变异系数增大[38]。刘海峰等[39]通过对STC大鼠模型进行在体结肠肌电检测分析发现，慢波频率及振幅异常可能导致肠道推进率发生改变或收缩不协调，慢波振幅的改变可能导致峰电位发放减少，而峰电位异常可能对结肠收缩产生影响，如表现为结肠运动能力减弱，肠道传输功能下降。故在体结肠肌电检测对STC模型的评价起重要作用。

3.5离体结肠肌力检测 STC系指结肠收缩运动障碍，表现为结肠内容物推进速度减慢或结肠收缩乏力[40]。与在体结肠肌肌电测定一样，离体结肠肌力检测亦是评估STC模型效果的一种指标，但离体结肠肌力检测在体外进行，避免了体内环境的影响，特别是一些胃肠肽的干扰。麻醉成功后取模型动物一段结肠组织制备成结肠肌条，将其放在37 ℃含克雷布斯-林格缓冲液的器官浴中待测定；施予结肠肌条一定的初始张力，用卡巴胆碱或氯化钾刺激其收缩，最后用生物信号记录分析系统记录及分析离体肠道肌力信号强度，从而评估STC动物模型肠道收缩运动能力[41]。STC动物模型常表现为离体结肠肌力减弱的特性。

3.6NO、VIP和P物质的测定 NO及VIP均是一种肠道抑制性神经递质，可通过扩散的方式进入肠道平滑肌细胞，诱导平滑肌舒张，从而抑制肠蠕动，减弱肠动力[42-43]。Zhu等[44]研究发现，STC组的血清NO和VIP水平升高，利用有效药物白芍总苷治疗后血清NO和VIP水平降低；推测其机制可能为白芍总苷通过减少抑制性神经递质(NO和VIP)促进肠蠕动。有研究证实，P物质是一种由肠神经元分泌的兴奋性神经递质，通过与肠神经元上的速激肽NK1受体偶联来调节ICC的起搏器电流，从而正向调节肠蠕动[45]。可见，这些脑肠肽物质与肠道运动密切相关，可通过对NO、VIP及P物质等进行直接检测来间接反映肠道功能情况，操作简单方便；但由于STC的影响因素众多且病因机制不明确，不能仅依靠这些脑肠肽物质来评价STC模型成功与否，而常作为一种次要性的评价指标。

4 小 结

STC动物模型的设计与构建理念应遵循临床STC的发病机制。在动物选择上，目前仍主张选用鼠、犬、兔等与人类消化系统相似的动物，但动物的生活习性及STC动物模型的发病机制仍与人类STC有显著差异；在造模方法上，除上述常见的造模方法外，还出现了一些特殊的造模方法，如ICC缺失型STC动物模型[46]及利用基因敲除技术建立神经菌毛蛋白1缺失型STC动物模型[41]等。随着社会的发展，“生理-心理-社会模式”在便秘发生发展中起重要作用，这也对STC动物模型的构建方法提出了更高要求，而不再单纯依靠化学药物。在STC动物模型评价指标上，随着“脑-肠轴”在便秘研究中的不断深入，脑肠肽分子可能成为今后评价STC的热点。目前关于STC的病理机制研究愈来愈广泛，因研究目的及方法不同，构建的动物模型也不尽相同，力求构建简单、重复性好、经济及科学的动物模型，使人类的STC能在动物模型上更好的复制。