诱导型一氧化氮合酶/一氧化氮在气道炎症中的研究进展

石炜弘，窦丹波，沈若冰

(上海中医药大学附属曙光医院传统医学科，上海 201203)

一氧化氮(nitric oxide，NO)作为一种具有极强生物活性的效应分子，与人体众多脏器功能和疾病发生发展密切相关[1]。NO在炎症反应中的作用机制复杂，不同酶产生的NO作用不一，可能同时具有抗炎和促炎作用[2]。NO由3种一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化L-精氨酸产生，其中诱导型NOS(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在呼吸道疾病的病理状态中广泛表达。与其他合酶不同，iNOS催化产生NO的效率最高，可以达到其他合酶的1 000倍，主要分布在巨噬细胞、白细胞等炎症细胞中，参与炎症性疾病的病理生理过程，与炎症关系更为密切。在炎症反应中NO水平升高是造成局部组织损伤的因素之一，由于iNOS在炎症反应发展过程中具有延迟表达和诱导表达的特点，炎症反应中NO持续产生，因此可通过调控iNOS活性来干预慢性炎症性疾病的发展[3]。目前众多实验表明，气道炎症中存在iNOS表达[4-6]，但其作用机制尚无定论。现就iNOS/NO在气道炎症中的研究进展予以综述，以为后续临床用药提供理论基础和实验基础，也为寻找合适药物治疗气道炎症提供一定的依据。

1 iNOS的形成与结构

人iNOS基因具有五核苷酸重复序列，长约37 kb，位于第17号染色体(17q11.2～17q12)[7-8]。在转录水平上，iNOS主要从外显子2(包含腺嘌呤-胸腺嘧啶-鸟嘌呤起始密码子)开始转录，但在细胞中其可从多个转录起始位点(如位于转录起始位点上游30 bp的TATA盒)开始转录，这种形式在一定程度上提高了转录效率和容错率[9]，同时外显子1的可变剪接会导致iNOS信使RNA(messenger RNA，mRNA)起始密码子腺嘌呤-尿嘧啶-鸟嘌呤之前的1个5′非翻译区出现包含8个部分重叠的可读框。人iNOS第27外显子中的3′非翻译区含有1个UUAUUAU基因序列，该序列具有易快速降解[10]和降低启动子活性[11]的特性，目前已被证明具有不稳定性。多转录起点、可变剪切加工和基因序列的不稳定性增加了iNOS合成mRNA种类的丰富性。且iNOS基因的3′端多聚区域下游10 bp处有1个富含GT的多聚信号区也可能造成基因表达及mRNA稳定性的差异[12]。当诱导合成mRNA后，由于缺乏mRNA 3′端AUUUA富含区参与mRNA降解，iNOS mRNA可以长时间翻译、合成iNOS，不易被降解。此外，与iNOS基因表达相关的启动因子位于5′非翻译区3.8 kb上游，这些位于5.2～6.5 、7.2 、16 、106～115 kb等区域的启动子均能增强iNOS的表达[13]。iNOS的表达受转录水平的调节，mRNA在转录水平不稳定性和其他组织特性，导致其翻译时与其他的NOS有较大差异。iNOS翻译成氨基酸后，通过折叠和盘绕的方式形成二级结构/结构域/蛋白质。

通过蛋白结构解析发现3种NOS的活性部位有4个区域，其中在M区域残基差异性较大，同时M区域也是影响iNOS活性的关键[14]。在iNOS空间结构上，包括3个结构域：加氧酶结构域(含血红素、四氢生物蝶呤和精氨酸)、CaM识别位点和还原酶结构域(含黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸还原酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)[15-17]。目前已知人iNOS加氧酶结构域是一种新的α-β折叠，主要由β折叠结构构建，由血红素、精氨酸、四氢生物蝶呤和一些NOS单体的氨基酸残基构成[7]。其中，血红素利用与疏水性和脂肪族性侧链产生相互作用范德华力，存在于蛋白质内部[18]；精氨酸通过与侧链末端结合，和碱性基、血红素共面；四氢生物蝶呤位于蛋白质内部；残基则通过一些氢键互相作用诱导突变[19]。iNOS形成空间结构后还需要结合辅基形成二聚体才具有催化活性。研究发现，iNOS二聚体的底部存在未检测到的四硫磺锌中心，且锌中心是所有NOS的共同特征[20]，每个单体与两个亚基(每个亚基有1个半胱氨酸110和1个半胱氨酸115)以四面体配位方式结合，与锌结合时净增加8个氢键，有利于二聚体的稳定[11]。

2 iNOS活性的调控

iNOS在基态下不表达，但在损伤、缺血、紫外线等因素刺激下，体内细胞因子[如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、干扰素、脂多糖]、细菌、病毒[呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)]等可诱导iNOS活化，且不受细胞内钙离子浓度影响，这些诱导因子作用于启动子/增强子和信号通路上均能不同程度地增强iNOS mRNA的表达。

iNOS mRNA启动子有核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、干扰素调节因子1、信号转导及转录活化因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)1α及环腺苷酸(cyclic adenylic acid，cAMP)反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)等识别点，其中NF-κB主要参与基因表达调控。iNOS基因的启动子或增强子区域有NF-κB的特异性结合位点，NF-κB活化后在转录水平参与iNOS基因表达调控，使iNOS mRNA迅速表达合成大量的iNOS[21]。实验证明，炎症因子[白细胞介素(interleukin，IL)-1、γ干扰素、TNF-α等]可通过作用于NF-κB刺激巨噬细胞产生大量iNOS和NO，从而参与iNOS和NO的生成调节[22]。且这些炎症因子单独刺激或联合刺激均能促进NF-κB活化，有研究证实，NF-κB通路抑制剂(BAY 11-7082)能抑制这3种炎症因子的联合刺激，导致滑膜细胞产生iNOS和NO明显减少，说明NF-κB对促进iNOS和NO的生成有调控作用[23]。

某些病毒也能影响NO的生成，如RSV感染后可通过上调iNOS基因的转录和蛋白表达生成更多NO，参与RSV感染引发的炎症过程。研究表明，RSV感染气道上皮细胞4 h后，核内活性NF-κB p65蛋白、iNOS mRNA和蛋白、细胞培养上清液中NO水平均升高，加入NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵后NF-κB活化明显受抑制，同时iNOS mRNA和蛋白表达下调；而相同情况下，加入NF-κB激动剂AG后，NO水平明显升高，说明RSV感染刺激iNOS的表达，从而产生大量的NO。综上表明，NF-κB活化对iNOS基因表达具有重要的正调控作用[24]。

γ干扰素和LPS在转录水平可诱导小鼠iNOS表达，如γ干扰素与其受体结合后，诱导STAT1磷酸化并使STAT1易位至细胞核，结合到特定序列上参与调控相应靶基因的表达，促进iNOS表达和NO产生[25]。γ干扰素对iNOS的诱导作用能通过TNF-α的分泌和NF-κB的激活被大大加强，其作用也可以被IL-4等抑制[26]。脂多糖不能直接通过活化STAT3从而调控iNOS的表达，但能间接协同γ干扰素刺激RAW264.7巨噬细胞，诱导细胞极化释放IL-6和γ干扰素等激活STAT3，来进一步诱导巨噬细胞IL-6、TNF-α和iNOS等炎症因子的表达，不同层级因子之间形成瀑布效应，引起组织坏死和脓毒性休克[27-28]。

3 iNOS/NO相关信号通路与气道炎症

iNOS可被多种因素(如炎症因子、细菌、病毒)诱导活化，调节iNOS在基因转录水平的表达，产生NO，再通过激活下游的部分信号通路，如环鸟苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)-蛋白激酶G(protein kinase G，PKG)-瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)、cGMP-PKG-促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路、cAMP-PKA-CREB通路、NF-κB通路等促进或抑制气道炎症的发生发展。

3.1iNOS/NO-cGMP-PKG-TRPV1与气道炎症 iNOS/NO能通过cGMP/PKG途径诱导TRPV1通道活化，促进速激肽尤其是P物质释放，导致气道神经源性炎症表达[29]。TRPV1受体属于配体门控非选择性阳离子通道，可被多种内源性或外源性理化因子直接激活或致敏，如辣椒素、热、酸、内源性大麻素等，兴奋时钙离子流动产生冲动[30]，在咳嗽过程中发挥重要作用。同时，TRPV1能被以NO为主的炎症介质降低活化阈值从而增加其敏感性[31]。

NO通过扩散作用于邻近神经元，或直接作用于其所在神经元，结合到可溶性鸟苷酸环化酶上，使可溶性鸟苷酸环化酶发生变构效应而被激活。活化的可溶性鸟苷酸环化酶催化3，5-鸟苷三磷酸形成cGMP，cGMP通过结合PKG的两个调节结构域的位点，激活PKG使其磷酸化。活化后的PKG可磷酸化TRPV1的两个丝氨酸残基，从而激活TRPV1[32]。增敏后的TRPV1受到钙离子流动引起的细胞膜去极化形成动作电位，释放P物质等速激肽，形成神经源性炎症，引起外周组织血浆蛋白外渗、血管通透性增加，组织中黏液分泌增多，继而促进肥大细胞脱颗粒释放IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子，并促进中性粒细胞黏附和移行，内皮细胞产生细胞间黏附分子-1，激发炎症反应[33]。

3.2iNOS/NO-cGMP-PKG-MAPK与气道炎症 MAPK激活后可诱导产生不同的炎症反应。MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其作为生物体内重要的信号转导因子之一，磷酸化级联激活后参与调节细胞生长、分化、氧化应激和炎症反应，包括胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、p38、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)三个亚型。iNOS可通过NO-cGMP通路调节MAPK信号通路[34]。研究表明，存在于炎症细胞中的iNOS受到外界刺激产生NO，NO可以激活PKG，再与MAPK上双磷酸化位点苏氨酸-x-酪氨酸结合活化MAPK产生炎症级联反应，然后磷酸化下游的蛋白激酶和转录因子，上调炎症介质的表达参与炎症反应[35-36]。

MAPK信号通路能加剧气道炎症反应，其主要包括ERK、JNK/蛋白激酶B、p38 MAPK三种通路。其中，ERK信号通路激活能促进炎症因子的生成和淋巴细胞、嗜酸粒细胞等大量炎症细胞活化浸润、趋化聚集，释放炎症介质，从而参与调节气道炎症和气道重构[37]。JNK/蛋白激酶B被激活表达会加重变应性哮喘模型小鼠的气道炎症[38]。同样，p38 MAPK被激活会下调糖皮质激素受体，抑制其磷酸化，减少糖皮质激素受体数量，并出现糖皮质激素抵抗现象，促进炎症反应，降低其他药物的抗炎效果[39]。糖皮质激素受体是一种配体依赖的转录活化因子，通过与糖皮质激素结合发挥治疗呼吸道炎症的作用[40]，同时反馈抑制p38 MAPK信号通路的激活，起到抗炎作用。

3.3iNOS/NO-cAMP-PKA-CREB与气道炎症 研究显示，在小鼠卵母细胞体外自发成熟时，NO可能通过cAMP-PKA调控CREB参与气道平滑肌炎症反应[41-42]。CREB作为转录增强子存在于真核细胞核内，而NO能诱导cAMP活化PKA，并结合CREB最主要磷酸化位点丝氨酸133使其活化，随后与靶基因启动子中的CRE序列(TGACGTCA)或半序列结合，活化转录因子的调控因子CBP/p300，促进CBP/p300参与相应转录因子的活化，从而诱导CREB靶基因转录，减少炎症因子的释放，减轻气道黏膜炎症反应等[43]。

由cAMP-PKA介导的CREB能够作用于下游的靶基因/靶蛋白，通过下调炎症介质等的表达参与抑制气道炎症反应的发生[44]。当气道平滑肌细胞发生炎症反应时，MAPK磷酸酶-1作为CREB的靶基因，通过iNOS/NO-cAMP-PKA-CREB通路，使MAPK磷酸酶-1表达水平明显升高，产生抑制炎症的作用[42]；血红素加氧酶-1作为血红素降解过程的限速酶参与炎症反应，经iNOS/NO-cAMP-PKA-CREB通路诱导表达后，能够限制炎症反应和减轻组织损伤[45]。另外，还有一些靶基因/靶蛋白(RGS10[46]等)也主要通过cAMP-PKA-CREB通路发挥抑制炎症的作用。

3.4iNOS/NO-NF-κB与气道炎症 NF-κB受多种诱导因子的调节，其通过促进抗凋亡基因表达产生炎症细胞，发挥炎症效应。NF-κB是初级转录因子，是对细胞有害刺激的第一反应者。此外，调控因子主要在转录水平对NF-κB信号转导通路进行调控，外界理化因素刺激使NF-κB抑制剂(inhibitor of nuclear factor kappa B，IκB)激酶活化，并将细胞内NF-κB/IκB复合物的IκB丝氨酸磷酸化，使得IκB亚基被泛素化修饰，进而被蛋白酶降解，释放NF-κB二聚体，入核与NF-κB结合位点结合启动转录。常态下NF-κB以无活性复合物形式存在，当它与相关转录调节因子活化整合后，通过发生核转位，调节细胞增殖分化，参与机体各种炎症和免疫反应[47]。NO对NF-κB的调控主要表现为稳定IκBα而抑制NF-κB的DNA结合活性，从而降低下游靶基因的表达，发挥抗炎作用。

研究表明，气道炎症初始阶段炎症因子引起NF-κB活化，导致iNOS基因表达而使NO生成增多[48]，此时低浓度NO与炎症因子通过刺激IκBα表达入核，进一步加强NF-κB活化，使其靶基因大量表达，炎症进一步发展。同时产生的过多NO又能负反馈作用于NF-κB抑制其活性，使靶基因转录受到抑制，NO及炎症因子生成减少，发挥抑制炎症发展过程的作用。

4 iNOS/NO与气道炎症相关的肺组织纤维化、气道高反应

iNOS/NO与气道炎症的发生发展有明确的相关性。当发生气道炎症时，气道上皮细胞作为气道的第一道细胞屏障，受到炎症因子的反复刺激可以造成气道上皮细胞的慢性损伤和再修复，导致上皮细胞分泌大量促炎因子、生长因子及重构细胞因子，进一步形成肺组织纤维化、气道高反应等其他肺部病理变化[49]。

肺组织纤维化是由于肺纤维细胞受到破坏时，肺间质会分泌胶原蛋白进行过度修补，从而形成炎症反应、肺泡结构紊乱和肺实质损伤等病理状态，而iNOS在肺纤维化过程中起重要的调节作用。在炎症因子诱导下，肺巨噬细胞和成纤维细胞中出现iNOS蛋白的过表达会引起氧化应激反应，促进肺内氧化损伤，导致肺组织纤维化产生。其中肺巨噬细胞能促进成纤维细胞增殖，而成纤维细胞与胶原的合成密切相关[50]。文献报道，iNOS阻断剂AG会抑制iNOS合成NO，同时会抑制炎症细胞的浸润，减少肺间质内胶原纤维数量，抑制纤维化的形成[51]。

研究发现，成纤维细胞的形态与细胞内iNOS表达的变化有关[52]。肺纤维化损伤初期，iNOS表达较强，成纤维细胞胞质丰富，而损伤晚期iNOS表达较弱，成纤维细胞形态变成长梭形。因此通过抑制iNOS表达，可起到缓解肺组织纤维化的作用，推断通过观察成纤维细胞形态的变化，可以判断抑制剂的作用时期。

气道高反应主要表现为在受到外界刺激时过早或过强烈的气道收缩，导致支气管明显狭窄的一种病理变化。而iNOS也参与这一过程，iNOS产生大量 NO，通过信号转导促使辅助性T细胞2活化，导致血管扩张、通透性增加、血浆外渗，嗜酸粒细胞浸润，促进炎症因子(如IL-4、IL-5)的表达，加重气道炎症，从而导致气道反应性增高、支气管收缩等。同时有研究表明，iNOS可以通过激发ERK1/2和JNK1/2磷酸化表达，促进炎症因子(如IL-6、IL-8及TNF-α)的产生，增加气道嗜酸粒细胞募集、黏液高分泌，从而产生气道高反应性[53]。因此，抑制iNOS/NO在炎症中的表达能够在一定程度上起到治疗和预防肺部疾病发生发展的作用。

5 结 语

iNOS通过效应分子NO发挥生物学作用，在生理病理下具有促炎和抗炎双重效应。气道慢性炎症的发生发展过程可能与iNOS/NO介导的过度炎症相关，其促炎作用主要表现为通过cGMP-PKG、MAPK和NF-κB等信号通路和其他炎症信号通路形成炎症网络，促进炎症因子表达和组织病理损伤。故推测，当iNOS/NO起促炎作用时炎症过程中其他物质抑制抗炎因子的表达或抗炎作用过弱被掩盖，说明iNOS在气道炎症性疾病发生发展中起关键和推进作用。因此，iNOS作为NOS之一，可能是目前研究NO促炎作用比较合适的靶点之一。可见，寻找选择性iNOS抑制剂干扰上述不同信号途径以抑制iNOS表达，起到治疗气道炎症性疾病的作用具有重要意义，未来需进一步探索。