糖蛋白的异常糖基化在前列腺癌中的研究进展

刘家舟，潘家骅，薛 蔚

(上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿科，上海 200127)

前列腺癌是全球男性发病率最高的恶性肿瘤之一[1]。前列腺癌的明确诊断依赖于有创的前列腺穿刺活检，前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen, PSA)检测的临床应用有效提高了前列腺癌的早期筛查率，但其作为无创诊断标志物的临床价值低[2]。目前，临床上仍缺乏能够有效鉴别前列腺癌与良性前列腺疾病，或反映前列腺癌治疗效果、预测前列腺癌患者预后的生物标志物。

糖基化是生物体内最常见的翻译后修饰。糖组学与糖生物学的发展使人们进一步认识到糖类物质在恶性肿瘤的发生发展中起至关重要的作用[3]，异常糖基化参与肿瘤细胞信号转导、肿瘤血管生成、肿瘤转移等过程[4]。现有临床应用中的肿瘤标志物绝大部分为糖蛋白，其表面异常聚糖修饰具有临床意义[5-6]，因此，肿瘤发生发展中糖蛋白的异常糖基化受到广泛关注。糖蛋白中聚糖部分与蛋白质部分的连接有两种方式，根据连接方式的不同可将糖蛋白聚糖分为N-连接型聚糖和O-连接型聚糖。前者指与蛋白质分子中天冬酰胺残基的酰胺氮相连的糖链，后者指与蛋白质分子中丝氨酸或苏氨酸的羟基相连的糖链[3]，细胞中糖蛋白糖基化过程在高尔基体与内质网中发生，由各类糖基转移酶、糖苷酶催化调控[7]。

前列腺是男性生殖器中最大的附属性腺，属于人体外分泌腺，其生理功能包括分泌富含糖蛋白的前列腺液参与生殖代谢。因此，前列腺恶性肿瘤的发生发展可能通过前列腺组织中或体液如前列腺液、尿液、血液中糖蛋白的异常糖基化反映，使聚糖成为反映前列腺疾病状态的生物标志物。对此，全球研究者进行了大量探索，揭示前列腺癌中PSA的异常糖基化、糖蛋白的核心岩藻糖基化、唾液酸化、β-N-乙酰葡糖胺单糖基修饰等糖基化修饰的变化。本文对糖蛋白糖基化在前列腺癌中的研究进展进行综述，总结糖蛋白异常糖基化在前列腺癌生物标志物方面的应用前景。

1 PSA的异常糖基化

PSA是由前列腺上皮分泌的一种丝氨酸蛋白酶，临床上被广泛用于前列腺恶性肿瘤的筛查[2]。然而，PSA作为前列腺恶性肿瘤的诊断指标，具有特异性低且预后价值有限的特点[8]。血清PSA的检测无法有效区分前列腺恶性肿瘤与良性前列腺病变，导致大量不必要的有创检查及过度治疗[9]。因此，不少研究者致力于探究PSA的糖基化特点，意图发现具有前列腺癌特异性的糖型结构，找寻比血清PSA更可靠的诊断试验。

PSA是一种含有237个氨基酸的单链糖蛋白，在第69位的天冬酰胺残基上有一处N-糖基化位点[10]。PERACAULA等[11]利用质谱分析法比较来自正常受试者精液和LNCaP前列腺癌细胞系纯化得到的PSA糖基化表征，发现来自LNCaP细胞系的PSA聚糖含有更多的的岩藻糖和N-乙酰半乳糖胺，以及更少的唾液酸。此后，有大量的研究运用不同方法比较了良恶性前列腺疾病患者体液中的PSA糖基化表征[11-20]。TAJIRI等[17]解析了前列腺癌患者血清及精液中PSA的N聚糖图谱，指出前列腺癌患者血清中PSA的N聚糖修饰富含岩藻糖基化的双天线寡糖，其中大部分含有α-2,3连接的唾液酸。FUKUSHIMA等[14]利用凝集素亲和层析法发现相较于良性前列腺增生患者，前列腺癌患者血清中的PSA具有更多的α-1,2-岩藻糖基和β-N-乙酰半乳糖胺。为了探寻高度恶性前列腺癌的诊断指标，FUJITA等[13]利用凝集素抗体酶联免疫吸附法测定69例前列腺穿刺患者尿液中的具有核心型岩藻糖基化修饰的PSA，发现前列腺癌患者尿液中核心岩藻糖基化的PSA含量显著降低，以此指标进行诊断试验，诊断Gleason评分≥7分的前列腺癌，曲线下面积达到0.72，高于血清或尿液PSA的诊断效能。LLOP等[18]提取了44例不同危险分度的前列腺癌患者与29例良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia， BPH)患者的血清PSA，提出利用酶联凝集素试验与凝集素亲和试验的方法，可以定量血清PSA的核心岩藻糖基化及α-2,3唾液酸化。前者在高危前列腺癌中显著降低，诊断高危前列腺癌的灵敏度达90%，特异度达95%；后者在高危前列腺癌中显著增高，灵敏度85.7%，特异度95.5%。

多项研究结果表明PSA的糖基化分析在前列腺癌的诊断及分期方面具有良好的应用前景。但上述研究仍有样本量较小及糖链解构不完全的不足，其诊断效能有待进一步验证。

2 核心岩藻糖基化

核心岩藻糖基化指岩藻糖残基通过共价键α-1,6连接至N聚糖的核心N-乙酰葡糖胺的过程，在肺癌、乳腺癌等多种癌症中均发现核心岩藻糖基化的增加[21]。研究者利用高效液相色谱或质谱检测发现在前列腺癌患者血清总糖蛋白中，相较于健康人群及良性前列腺增生患者，N聚糖的核心岩藻糖基化显著增加[22-23]。

核心岩藻糖基化的过程由α-1,6岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase 8, FUT8)催化。WANG等[24]通过免疫组化染色发现FUT8的表达在转移性前列腺癌及高Gleason评分前列腺癌组织中显著上升，且在LNCaP细胞系中，FUT8的过表达显著提高了前列腺癌细胞的迁移能力。HÖTI等[25]的研究发现FUT8的表达在去势抵抗性前列腺癌LAPC4细胞系中有更进一步上调，且FUT8的过表达降低了前列腺癌细胞PSA的分泌，进而提出FUT8的上调可能与前列腺癌去势抵抗的发生有关。上述研究提示核心岩藻糖基化具有潜力成为诊断性生物标志物，但其在前列腺癌发生发展中的作用机制仍需进一步探索。

3 唾液酸化

唾液酸化是指唾液酸残基通过共价键连接至聚糖末端。异常唾液酸化可能与多种癌症的发生发展具有密切关系[21]。在前列腺癌患者中，血清总糖蛋白唾液酸化水平有显著程度的上升[26-27]。其中MICHALAKIS等[27]的前瞻性研究纳入70例具有下尿路症状的患者行前列腺穿刺活检，血清唾液酸水平在该人群中诊断前列腺癌可达到86%的灵敏度和84%的特异度。ZHANG等[26]研究发现血清唾液酸水平是前列腺癌骨转移的独立预测因素。前列腺癌患者血清总N聚糖中α-2,3唾液酸水平相较于良性前列腺增生患者显著上升[22]。

唾液酸化Tn抗原(sialyl-Tn, sTn)是一类被截短的O聚糖，由1个唾液酸残基通过共价键α-1,6连接于N-乙酰半乳糖胺形成。sTn的出现提示肿瘤组织中不完全糖基化的发生，并与多种癌症的转移及不良预后相关[28]。sTn的形成由α-N乙酰半乳糖胺-α-2,6唾液酸转移酶(ST6 N-Acetylgalactosaminide Alpha-2,6-Sialyltransferase 1, ST6GalNAc1)催化。前列腺癌细胞中，ST6GalNAc1的转录由雄激素受体通路介导，其表达调控sTn的合成，具有降低细胞粘附的作用[29]。在膀胱癌患者中sTn作为循环肿瘤细胞表面生物标志物的潜力正在被进一步探索[30-31]，但在前列腺癌中sTn的预测作用尚无报道。

唾液酸化Lewis抗原(Sialyl Lewis X, SLeX)也是一类肿瘤相关的血型抗原寡糖链，具有末端唾液酸化及远端岩藻糖基化修饰的特点，位于糖蛋白聚糖链末端[32]。SLeX作为选择素配体，介导前列腺癌细胞与E-选择素的结合，增强肿瘤细胞与内皮细胞的粘附，从而促进肿瘤转移[33-34]。在前列腺癌患者中，SLeX的上调提示了不良预后[35]。在前列腺癌组织中核心-2-N乙酰葡糖胺转移酶(core 2 β-1, 6-N-acetylglucosaminyl-transferase-1, GCNT1)的表达上升，进而显著上调了O连接型SLeX在PSA、PAP、MUC1等糖蛋白聚糖中的合成[36]，这也提示SLeX具有成为前列腺癌糖蛋白靶标的潜力。

4 β-N-乙酰葡糖胺单糖基修饰

β-N-乙酰葡糖胺单糖基修饰(O-GlcNAcylation)指β-N-乙酰葡糖胺以共价键结合于糖蛋白丝氨酸或苏氨酸残基上。不同于N聚糖或O聚糖修饰，这种糖基化修饰是在O-GlcNAc糖基转移酶(O-GlcNAc transferase, OGT)催化下，发生于细胞质或细胞核中的可逆性过程[37]。β-N-乙酰葡糖胺单糖基修饰在多种癌症的发展中起重要作用，与肿瘤细胞增殖和侵袭相关[37]。在前列腺癌中，GU等[38]发现前列腺组织中β-N-乙酰葡糖胺单糖基修饰显著增加，并具有诱导BPH细胞向癌细胞恶变的能力。KAMIGAITO等[39]提出前列腺穿刺组织中β-N-乙酰葡糖胺单糖修饰的上调提示不良预后。于此对应的是，ITKONEN等[40]对1 987例前列腺癌患者组织进行免疫组化染色，发现OGT蛋白水平上调与肿瘤Gleason评分、TN分期及患者生化复发显著相关。

5 体液N聚糖组学检测

前列腺癌的发生发展伴随着异常糖基化的广泛发生，前列腺癌患者尿液、血清等体液是肿瘤的无创诊断甚至预后判断的重要材料，而体液中糖蛋白的糖组学分析为无创检测提供了进一步支持。N聚糖可被肽-N-聚糖酶F/A(peptide-N-glycanase F/A, PNGaseF/A)自核心N-乙酰葡糖胺处与蛋白质部分完整游离，但尚无聚糖酶能准确分离O聚糖，因此，N聚糖组学检测在前列腺癌的应用更为成熟。基于外切糖苷酶序贯消化分析[41]，多个研究利用不同来源的体液，通过不同高通量N聚糖分析方法建立了前列腺癌的N聚糖图谱[22, 42-50]。

SALDOVA等[22]利用高效液相色谱法分析了13例BPH与34例前列腺癌患者的血清总N聚糖图谱，提出前列腺癌患者血清中核心岩藻糖基化的双天线聚糖和α-2,3唾液酸显著增加，基于其N聚糖图谱建立的诊断模型效能高于传统血清PSA。KAWAHARA等[43]提出一种基于液相色谱与质谱联用的分析方法，提取前列腺癌和BPH患者各5例的尿液游离糖蛋白，建立了尿糖蛋白组学图谱，其中基于N聚糖谱建立的诊断模型曲线下面积达到1。VERMASSEN等[44-45]通过基于DNA测序仪的荧光糖电泳(DNA sequencing equipment-fluorophore assisted carbohydrate electrophoresis, DSA-FACE)分析54例健康人、93例BPH及74例前列腺癌患者尿液N聚糖，建立了尿液糖组学标志物模型：未岩藻糖基化的双天线、三天线、四天线糖链总量与三天线糖链含量的比值，可为血清PSA提供附加的诊断价值，在PSA灰区(PSA=4～10 ng/mL)具有突出的诊断效能。ISHIBASHI等[46]利用多糖印迹法结合飞行时间质谱分析了共计738例健康人、BPH患者及不同分期前列腺癌患者的血清N聚糖图谱，发现去势抵抗性前列腺癌患者血清中三天线与四天线N聚糖显著上升，并基于此发现成功预测1例ADT治疗中的前列腺癌患者进入去势抵抗阶段。MATSUMOTO等[42]利用类似分析方法，通过9种N聚糖链的定量组合建立了CRPC的N聚糖评分，在共计693例血清样本中，判断CRPC的敏感度为87%，特异度为69%，且对患者的预后具有独立预测作用。

基于体液的无创检测因个体异质性往往不能达到令人满意的诊断效能，上述研究中利用血清及尿液的N聚糖组学分析在回顾性研究中展现了其成为无创诊断标记物的潜力，但诊断价值有待大样本前瞻性研究验证，判断患者分期及预后的临床意义仍待挖掘。

6 总结与展望

大量新兴研究的结果表明前列腺癌的发生发展伴随着糖蛋白异常糖基化的发生，这些糖基化模式的变化在体外细胞系、组织样本及体液样本中均有发现。其中核心岩藻糖基化上调、唾液酸化增加等异常糖基化在多种恶性肿瘤中均有报道[21]，前列腺癌中糖蛋白的异常糖基化是否能成为特异性标志物，其变化是否由前列腺癌特异性的通路介导仍有待探索。催化sTn抗原合成的糖基转移酶ST6GalNAc1是雄激素受体通路的直接转录目标[29]。参与β-N-乙酰葡糖胺单糖基修饰的己糖胺生物合成途径被发现由雄激素受体通路调控[40]。MUNKLEY等[51]通过RNA测序发现一组催化异常糖基化修饰的糖基转移酶受外源性雄激素刺激显著上调。以上研究结果表明前列腺癌中糖蛋白的异常糖基化可能部分由雄激素受体通路介导，但仍需进一步探究。

糖组学是继基因组学和蛋白组学后的新兴研究领域。聚糖分子具有多变的键连接方式和分支方式，同样的蛋白质因糖链的结合位置、糖基数目、糖基序列不同可产生的不同分子形式，且从基因组信息无法有效预测最终的聚糖结构，因此蛋白质组学大多数方法不适用糖组学研究，聚糖结构分析因存在技术困难而进展相对缓慢。近年来，基于质谱、高效液相色谱、毛细管电泳等建立的高通量聚糖鉴定技术的开展为糖组学的进一步深入奠定了基础，利用体外细胞系、组织标本、体液等样本可建立糖蛋白糖基化图谱，从而反映肿瘤中糖蛋白的糖组学变化。然而，现有技术普遍存在预处理复杂、样本需求量高、经费较高等不足，尚未能将研究结果转化为易于检测且临床价值高的临床生物标志物。

基于体液的生物标志物在多种恶性肿瘤中已得到广泛的应用，体液中糖蛋白的聚糖结构具有成为新标志物的巨大潜力[52]。在前列腺癌患者的体液中，前列腺液作为前列腺的直接分泌物包含着最丰富的前列腺相关糖蛋白信息。经肛门前列腺按摩后，前列腺液可通过尿道排出并被采集，该操作为泌尿外科常规无创检查。基于前列腺液的蛋白组学研究成果提示前列腺液或前列腺按摩后尿液中糖蛋白表征对前列腺疾病具有检测价值[53]，但前列腺液具有糖蛋白含量不稳定、无法标准化取样、质控难以把握的缺点。聚糖分析方面，NYALWIDHE等[48]采集了高危前列腺癌、低危前列腺癌、无前列腺癌3组各10例患者的前列腺液，建立3组样本池，通过飞行时间质谱法解析其中N聚糖结构，发现高危前列腺癌患者前列腺液中三天线、四天线聚糖含量降低，平分型N乙酰葡糖胺结构升高，得出前列腺液N聚糖表征可反映前列腺疾病状态。但该研究混合了不同患者前列腺液进行检测，其结果有待进一步验证。前列腺液中糖蛋白的异常糖基化有待新的研究进行解析。

本文揭示了前列腺癌中糖蛋白的异常糖基化伴随着糖基转移酶的异常表达广泛存在，其具有协助诊断、预测分期、判断预后的临床应用潜力，糖组学技术的临床转化值得期待，而异常糖基化的功能信息、调控机制有待未来新的研究者深入探索。