前列腺癌组织中胶原三股螺旋重复蛋白1基因转录水平微滴数字PCR检测方法的建立及验证

杨德平，张艳，刘莹，张培燕，孔娜娜，郑江花，3

1.上海健康医学院附属周浦医院医学检验科，上海 201318；2.上海中医药大学附属龙华医院检验科，上海200032；3.同济大学医学院附属上海市同济医院中心实验室，上海 200092

前列腺癌是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在男性恶性肿瘤相关死亡原因中列第三位［1］。随着我国生活水平、诊断技术的提高及社会老龄化程度加大，前列腺癌的发病率也呈逐年升高趋势［2］。目前，总前列腺特异抗原（total prostate specific antigen，TPSA）仍是我国前列腺癌的首要诊断指标，早期检测TPSA可降低前列腺癌的死亡率［1］。但中国前列腺癌联盟（Chinese Prostate Cancer Consortium，CPCC）研究数据显示，患者血清中TPSA含量为4～10 ng／mL时，前列腺穿刺阳性率约为26%［3］，这可能是由于TPSA检测结果受炎症、直肠指诊和良性前列腺增生等因素的影响，易产生假阳性［4］。因此，临床迫切需要寻找新的前列腺癌诊断标志物，为前列腺癌的早期准确筛查提供新的指标。

胶原三股螺旋重复蛋白1（collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1）是分泌型糖基化蛋白，相对分子质量约28 000，在人和大鼠中，其氨基酸序列同源性为92%［5］。有研究显示，CTHRC1在癌症组织中可参与多种信号通路调节，并促进癌细胞侵袭和转移，且在人胰腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和大肠癌中呈高表达［6-7］，但CTHRC1在前列腺癌中的表达情况鲜有报道。微滴数字PCR法（droplet digital PCR，ddPCR）是近年研发的一种快速、准确、灵敏度高和可实现绝对定量的PCR法［8］，是一种新型的分子生物学检测技术。本研究旨在建立前列腺癌组织中CTHRC1基因转录水平的ddPCR检测方法，并进行验证，以期为前列腺癌的临床诊断提供一个准确性较高的检测方法。

1 材料与方法

1.1 样本 收集2019—2020年复旦大学附属中山医院泌尿外科住院患者的73份前列腺穿刺组织样本，其中前列腺癌组织样本40份，患者年龄42～85岁，平均年龄（70.56±8.42）岁；非前列腺癌组织样本33份，患者年龄49～85岁，平均年龄（68.56±7.67）岁。

1.2 主要试剂及仪器EcoRⅠ内切酶及柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；第一链cDNA合成试剂盒购自美国赛默飞公司；TPSA检测试剂盒、i2000SR免疫化学发光分析仪及其配套试剂购自美国雅培公司；QX200TM微滴生成仪及QX200TM微滴读取仪购自美国BIO-RAD公司。

1.3 引物设计及合成 根据GenBank中登录的CTHRC1序列（NM_001256099.2），经序列比对分析，针对CTHRC1保守区，应用Primer 5.0软件设计引物，CTHRC1-F：5'-CTTCATATGTGGCCGCCAGG-3'，CTHRC1-R：5'-AGATGAGCCCCTGGAAAGCA-3'。同时设计β-actin（JQ619775）引物，β-actin-F：5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'；β-actin-R：5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 质粒的构建 采用柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒提取前列腺癌穿刺组织阳性样本总RNA，第一链cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA，以其为模板扩增CTHRC1保守区基因片段。委托生工生物工程（上海）有限公司构建含CTHRC1保守区基因片段的质粒PUC57，并鉴定质粒的碱基数和浓度，换算出拷贝数。将质粒PUC57经EcoRⅠ酶酶切，线性化的质粒用于后续方法的验证。

1.5 方法的建立 采用柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒提取标本总RNA，第一链cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA，以其为模板进行ddPCR扩增。PCR反应体系为：2×ddPCR Supermix Evagreen 10µL，上下游引物（10µmol／L）各0.4µL，模板3µL，ddH2O 6.2µL，共20µL。采用QX200TM微滴生成仪生成微滴，用PX1TMPCR板封口机热封96孔板，再用QX100TMPCR仪进行扩增，PCR反应条件为：95℃5 min；95℃30 s，60℃1 min，共40个循环；4℃5 min；90℃5 min；4℃保存。扩增后将96孔板置QX200TM微滴读取仪进行分析，检测到荧光信号的记为阳性反应，未检测到荧光的被记为阴性反应。最后应用QuantaSoft分析软件计算质粒的绝对浓度。

1.6 方法的验证

1.6.1 引物特异性 取3份前列腺癌阳性穿刺标本，用柱式动物组织总RNA纯化试剂盒抽提总RNA，第一链cDNA合成试剂盒反转录为cDNA，以其为模板，CTHRC1-F／R和β-actin-F／R为引物进行扩增，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。同时用这2对引物对6份前列腺癌穿刺阳性标本进行ddPCR检测，验证两对引物的特异性。

1.6.2 正确度 用ddH2O将线性化质粒PUC57稀释至104、103、102、101及100copies／µL，采用建立的方法进行检测，每个稀释度重复检测3次，将检测值和理论值进行Log10值转换。

1.6.3 精密性

1.6.3.1 重复性 用ddH2O将线性化质粒PUC57稀释为101和103copies／µL，采用建立的方法进行检测，每个浓度重复检测20次，计算SD平均值和CV。

1.6.3.2 中间精密性 用ddH2O将线性化质粒PUC57稀释为101和103copies／µL，采用建立的方法于4个不同时间点进行检测，每个浓度重复检测20次，计算SD，平均值和CV。

1.6.4 检测限 用ddH2O将线性化质粒PUC57稀释为100copies／µL，采用建立的方法重复检测10次。

1.6.5 线性范围 用ddH2O将线性化质粒PUC57稀释为105、104、103、102、101和100copies／µL，采用建立的方法进行检测，每个稀释度重复3次，取平均值。以理论值为横坐标，检测值（拷贝数转换Log10值）为纵坐标，建立线性回归曲线。

1.7 方法的应用 采用建立的方法检测73份临床前列腺组织穿刺标本中CTHRC1基因转录水平，TPSA检测试剂盒检测相应患者血清中TPSA含量，并将TPSA检测结果进行ROC曲线分析，以获得CTHRC1-TPSA指标联合检测对诊断前列腺癌的预测概率。

1.8 统计学分析 应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差（）表示，ddPCR和TPSA法检测73份临床前列腺组织穿刺标本结果间的比较采用Mann-Whitney U检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 质粒的鉴定 质粒含有碱基数为3 070 bp，质粒浓度为40 ng／µL，即1.19×1010copies／µL。

2.2 方法的验证

2.2.1 引物特异性CTHRC1-F／R和β-actin-F／R引物扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析，可见174和144 bp的基因片段，大小与预期一致，见图1。6份前列腺癌穿刺标本采用两对引物进行ddPCR检测，均为阳性，表明引物特异性良好，见图2。

图1 两对引物扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products with two pairs of primers

2.2.2 正确度 检测值和理论值之间的Log值差异均＜1，且拟合度高，R2=0.995 9，见图3。表明该方法具有良好的正确度。

2.2.3 精密性

2.2.3.1 重复性103和101copies／µL质粒重复检测20次的均值分别为1 110.500和12.378，SD分别为52.863和1.178，CV分别为0.048%和0.095%，CV均＜10%。表明该方法具有良好的重复性。

2.2.3.2 中间精密性103和101copies／µL质粒于4个不同时间重复检测20次的均值分别为1 122.000和11.918，CV均＜15%，SD分别为77.432和1.556，CV分别为0.069%和0.131%。表明该方法具有良好的中间精密性。

2.2.4 检测限 重复检测10次，100copies／µL质粒PUC57的检测值分别为2、1、0.8、1.7、0.8、1.7、1.1、1.7、1.7、2.1 copies／µL，因此确定该方法的检测限为100copies／µL。

2.2.5 线性范围 检测值在100～104copies／µL范围内，与理论值呈良好的线性相关性，线性方程为：y=0.986 0x-0.880 9，R2=0.997 2，见图4。当模板数大于105copies／µL时，ddPCR阳性微滴数达到饱和状态，基底荧光信号基本消失，检测值与理论值之间发生了偏离不相符，见图5。

图2 CTHRC1-F／R（A）和β-actin-F／R引物（B）检测前列腺癌穿刺标本的ddPCR结果Fig.2 Test results of prostate cancer biopsy specimens determined by ddPCR with CTHRC1-F／R（A）andβ-actin-F／R（B）primers

图3 正确度验证结果Fig.3 Verification for accuracy

图4 ddPCR检测CTHRC1的线性范围Fig.4 Linear range of determination of CTHRC1 by ddPCR

图5 105 copies／µL质粒的ddPCR检测结果Fig.5 Determination of 105 copies／µL plasmid by ddPCR

2.3 方法的应用ddPCR法检测40份前列腺癌穿刺标本中CTHRC1基因转录水平Log10转换后均值为21.40 copies／µL，33份，非前列腺癌穿刺标本中CTHRC1基因转录水平Log10转换后均值为10.47 copies／µL，前者显著高于后者（Z=-4.339，P＜0.001）。ROC曲线分析表明，CTHRC1+TPSA联合检测可大幅提高前列腺癌检测的曲线下面积（area under the curve，AUC），特异性及敏感性也高于TPSA和CTHRC1单独检测，表1和见图6。

表1 ROC曲线评价TPSA、CTHRC1及CTHRC1+TPSA联合检测统计结果Tab.1 Statistical results of TPSA，CTHRC1 and CTHRC1+TPSA evaluated by ROC curve

图6 CTHRC1、TPSA及CTHRC1+TPSA联合检测诊断前列腺癌的ROC曲线Fig.6 ROC curve of prostate cancer diagnosed with CTHRC1，TPSA and CTHRC1+TPSA

3 讨 论

近年，我国前列腺癌的发病率和死亡率有逐年增高的趋势，早期诊断的准确性是影响其诊疗效果的主要因素。目前，TPSA和游离前列腺特异抗原（free prostate specific antigen，fPSA）在临床上运用最为广泛，其中TPSA特异性较低，在前列腺炎及前列腺增生等良性前列腺疾病中也会升高；fPSA存在含量低、半衰期短、稳定性差等缺点［9-10］，因此，深入研究前列腺癌发生发展机制，发现早期诊断前列腺癌新的分子标志物，对于前列腺癌的治疗和预后具有重要意义。CTHRC1是一种分泌性蛋白，其高表达可增加癌细胞的浸润能力和转移风险，从而加剧病情进展［11］。研究显示，CTHRC1与多种实体肿瘤的转移密切相关［12-14］，但其与前列腺癌的关系鲜有报道。

ddPCR法不依赖于外部校准曲线，能敏感和特异地检测核酸，与qPCR法比较，对PCR抑制物具有较高耐受性［15］，已成为一种新的分子检测技术，在癌症检测及核酸定量中广泛应用［16-17］。本研究针对CTHRC1基因的一段保守区域设计引物并进行验证后，构建了含该保守区域的质粒PUC57，用于ddPCR法的验证。结果表明，ddPCR法的检测值与质粒理论值之间具有较高的拟合度（R2=0.995 9），表明该方法具有良好的正确度；重复性CV＜10%，中间精密性CV＜15%；ddPCR法检出限达100copies／µL；检测值在100～104copies／µL范围内，与理论值呈良好的线性相关性，R2=0.997 2。方法验证结果表明，ddPCR法适合前列腺癌患者临床样本中CTHRC1基因转录水平的检测，是一种可靠、准确、灵敏的癌症研究工具。

本研究采用建立的ddPCR法检测了40例前列腺癌穿刺标本和33份非前列腺癌穿刺标本中的CTHRC1基因转录水平，结果表明，CTHRC1基因在前列腺癌患者样本中的转录水平显著高于非前列腺癌样本（P＜0.001），初步证实CTHRC1基因转录水平在前列腺癌中高表达。联合检测是筛查前列腺癌的有效手段，可增加发现使局限性前列腺癌和无症状的隐匿性前列腺癌的概率，从而使可根治的前列腺癌能被早期发现［18］。因此，本实验采用ROC曲线分析CTHRC1与TPSA联合检测对前列腺癌的诊断性能，发现联合检测比单独TPSA和CTHRC1检测具有更高的AOC，因此联合检测CTHRC1与TPSA有利于进一步提高对前列腺癌的诊断能力，为前列腺的早期治疗和改善预后提供帮助。

综上所述，ddPCR法可用于前列腺癌患者组织中CTHRC1基因转录水平的检测，CTHRC1在前列腺癌中异常表达提示其有可能成为前列腺癌患者的新筛查指标和治疗靶点，但CTHRC1在前列腺癌发展中的具体作用机制尚需进行深入研究。