壮骨方治疗肌少—骨质疏松症的作用机制分析

蒋梦春，胡洲映，李双蕾，陈文辉，孙煜宇，何嘉丽，李君宇

1广西中医药大学研究生院，南宁 530001；2湛江市第一中医医院内分泌科；3广西中医药大学第一附属医院内分泌科

肌少—骨质疏松症（SOP）是指患者符合骨质疏松症（OP）临床诊断的同时伴有骨骼肌质量、数量和（或）功能下降。SOP后期可并发骨质疏松相关性脆性骨折，严重危害老年人健康［1］。在中国老年人群中，男性、女性SOP患病率分别为10.4%和15.1%［2］。SOP的致病机制复杂，体力活动减少、内分泌因素、炎症因子浸润、肌肉或骨细胞释放促分解代谢的物质增多等多种因素都可引起肌肉、骨骼受损［3］。SOP属于中医“肉痿”“骨痿”“虚劳”“骨痹”等疾病范畴。《难经·二十四难》云：“骨肉不相亲，即肉濡而却；肉濡而却……骨先死。”又因“脾主身之肌肉，肾主身之骨髓”，脾肾亏虚，精气不足以荣骨充肌，则骨伤肌短，骨枯肉软，肉软骨死。广西名中医李双蕾教授提出，脾肾不足、瘀血阻络、骨髓失养是OP的核心病机，并以益肾填精、活血化瘀、通络止痛为治疗总则，精心选药组成壮骨方。本课题组前期动物实验研究证实，壮骨方可能通过Ras-Raf-MAPK信号通路促进成骨细胞生成、分化并增强其活性，通过抑制炎症反应及增加瘦素、胃饥饿素等水平，发挥预防肌肉萎缩和骨量流失的作用［4-6］。2021年6月—2022年4月，本研究运用网络药理学及分子对接方法，整合分析壮骨方的有效活性成分及治疗SOP的潜在作用靶点，进一步挖掘壮骨方治疗SOP的作用机制，为后续研究提供思路。

1 资料与方法

1.1 壮骨方活性成分及靶点筛选通过检索TCMSP数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）获取壮骨方中淫羊藿、枸杞子、黄芪、骨碎补、杜仲、牛膝、山药、白术、丹参、三七、甘草的活性成分，以口服生物利用度≥30、类药性≥0.18为条件进行筛选。在TCMSP中Related Targets标签获取各活性成分的靶点，并对所有中药的活性成分、活性成分对应的靶点、活性成分对应的中药名进行整合。用Cytoscape3.8.0软件构建“中药—活性成分—靶点”网络图。将检索获得的中药活性成分作用靶点，通过Unipro数据库（https：//www.uniprot.org/）进行靶点基因注释。

1.2 SOP疾病靶点获取通过GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）获取SOP的疾病靶点，输入“osteoporosis”“sarcopenia”“sarco-osteopenia”检索后得到相关靶点。

1.3 壮骨方活性成分作用于SOP核心靶点筛选利用R软件，运用内置函数intersect对中药成分的相关靶点与疾病相关靶点取交集，并使用R软件包Venn Diagram制作维恩图，得到壮骨方活性成分可能作用于SOP的潜在靶点。将交集靶点导入到STRING数据库（https：//string-db.org/），选定“Homo sapiens”物种，将置信度评分设置为＞0.9，并选择隐藏蛋白质相互作用（PPI）网络图中断开连接的节点，其余参数默认，构建交集靶点相互作用网络拓扑。利用Cytoscape3.8.0软件中Cythubba插件计算网络各节点的拓扑参数（DMNC、Degree、Closeness和Betweeness），以大于这四个拓扑参数中值为筛选条件，得到壮骨方治疗SOP的核心靶点。

1.4 核心靶点基因功能分析利用Cytoscape3.8.0软件的GlueGO插件对核心靶点进行GO分析及KEGG富集分析。设定P＜0.01，采用Bonferroni法进行校正，最小与最大基因富集单位为3、8，Kappa Score默认为0.4。

1.5 核心活性成分与核心靶点的分子对接验证将筛选出的核心活性成分及核心靶点用于分子对接。从Pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载小分子化合物结构，在RCSB PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）下载相关靶点的蛋白结构，利用Auto Dock软件作去除水分子、氢等处理，运用AutoDock MGL Tools1.5.6、Pymol2.6、AutoDock Vina1.1.2软件进行分子对接模拟，获取对接能量。

2 结果

2.1 壮骨方活性成分和作用靶点筛选结果壮骨方中11味中药的活性成分共297个，其中淫羊藿21个、枸杞35个、黄芪16个、骨碎补15个、杜仲25个、怀牛膝16个、山药12个、白术4个、丹参58个、田七7个、甘草88个。利用Cytoscape3.8.0软件构建“中药—活性成分—靶点”网络图，见OSID码图1。对应靶点数量排名前五的活性成分为槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹参酮Ⅱa、柚皮素，对应靶点分别有108、48、44、29、27个。

2.2 壮骨方活性成分治疗SOP的核心靶点筛选结果搜索到SOP疾病靶点4 176个（已去掉重合基因）。将4 176个疾病靶点与297个壮骨方活性成分作用靶点交集，获得交集靶点173个，见OSID码图2。将173个交集靶点导入STRING数据库建立PPI网络，见OSID码图3。计算出PPI网络的拓扑参数，分析得出壮骨方治疗SOP的核心靶点共16个，见表1。

表1 壮骨方治疗SOP核心靶点的网络拓扑学参数

2.3 核心靶点基因GO分析结果对16个核心靶点进行GO生物过程分析，结果显示核心靶点基因主要涉及对肌肉拉伸的反应、对组织生长的正向调节作用、细胞对血管内皮生长因子刺激的反应、脂多糖介导的信号通路、蛋白质的入核转运等生物过程。详见OSID码图4。

2.4 核心靶点基因KEGG富集分析结果KEGG富集分析结果共22条，交集靶点主要涉及糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物—糖基化终末产物受体（AGE-RAGE）信号通路、催乳素（GnRH）信号通路、白细胞介素17（IL-17）信号通路、Toll样受体信号（TLR）通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路等。详见OSID码图5。

2.5 核心靶点—通路网络构建情况利用Cytoscape3.8.0软件的ClueGo插件，列出壮骨方治疗SOP核心靶点的代表性富集KEGG途径。基于表2可看出，壮骨方中核心靶点FOS、RELA、MAPK8、IL-4、ESR1、JUN、TP53、STAT3等可干预低氧诱导因子1（HIF-1）信号通路、脂肪细胞因子信号通路、胰岛素抵抗、TLR信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、GnRH信号通路、2型糖尿病、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路等。

表2 壮骨方治疗SOP核心靶点KEGG富集分析结果

2.6 壮骨方核心活性成分与核心靶点的分子对接结果对接完成后，得到化合物与蛋白结合的自由能为负值，一般认为绝对值大于7时，小分子与蛋白结合的可能性较大。由表3可见，壮骨方核心活性成分与核心靶点的结合较好。

表3 壮骨方核心活性成分与核心靶点分子对接的结合能（kJ/mol）

3 讨论

年龄增长相关的骨骼肌质量、肌肉强度下降是不可避免的自然过程，是诱发SOP的重要因素。SOP可导致身体平衡力下降，增加跌倒及脆性骨折发生风险，已成为中老年患者死亡、致残的高危因素之一，因此有效防治SOP意义重大。

壮骨方中淫羊藿温肾强骨、黄芪健脾益气，共奏补脾肾、强筋肉、助精髓之效，共为君药；山药、枸杞子、白术、甘草可补脾阴、滋肾精，杜仲、骨碎补补肾健骨，怀牛膝益补肝肾，合为臣药；佐以丹参、田七活血化瘀止痛，全方滋补脾肾、益气活血并用，补泻兼施。

本研究通过药物成分靶点分析，筛选壮骨方治疗SOP的关键活性成分为槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹参酮Ⅱa、柚皮素等。槲皮素是一种强有力的抗氧化剂，可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化及抗凋亡能力［7］，提高骨骼肌细胞活力以预防肌肉萎缩［8］。丹参酮可抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路上细胞外信号调节激酶的高表达及磷酸化，促进软骨细胞增殖及抗软骨损伤［9］。丹参酮还具有类雌激素作用，可增强成骨细胞活性、抑制破骨细胞活性，延缓骨骼肌萎缩及骨量流失［10］。山奈酚通过抑制炎症反应和脂肪生成，减轻氧化应激，同时抑制成骨细胞凋亡及破骨细胞分化来实现骨骼保护作用［11］。柚皮素具有抑制破骨细胞分化及功能相关的特异性基因表达的作用，可降低去卵巢小鼠的骨转换速率以提高骨质量［12］。

PPI网络分析结果显示，壮骨方治疗SOP核心靶点排名靠前的有FOS、RELA、IL-4、ESR1、JUN、TP53、STAT3、MAPK3、MAPK8、MAPK14、AKT1等，我们通过分子对接技术，证实了壮骨方的核心活性成分与核心靶点对接良好，表明上述靶点可能是壮骨方治疗SOP的核心靶点。MAPK3、MAPK8、MAPK14都属于MAPK家族成员。MAPK主要负责细胞外信号的核内传递。细胞外刺激激活MAPK信号转导通路的三级激酶级联反应，继而活化C-JUN、c-FOS、STAT3等转录因子，促进核内靶基因表达，继而调节成骨细胞、破骨细胞、肌卫星细胞、血管内皮细胞、免疫细胞等多种细胞的生理病理过程，影响骨骼及肌肉的合成、代谢和损伤修复［13-17］。骨重塑过程依赖于促炎介质和抗炎介质之间的平衡，促炎介质的持续存在可增加骨流失及肌肉萎缩的风险［18］。多项研究表明，FOS、RELA、IL-4、IL-6、STAT3、MAPK参与异常的炎症和免疫应答过程［19-21］。MAPK14、RELA、STAT3被证实与血管重建及血管内皮生成密切相关，对骨骼微结构（皮质骨及骨小梁）、肌肉组织的生长与再生十分重要［22-24］。AKT1则是多条骨骼、肌肉合成代谢相关信号转导通路的关键参与者之一，缺乏AKT1的小鼠显示出骨骼缺陷及肌肉再生障碍［25］。

我们通过Clugo分析，得出核心靶点的代表性富集KEGG途径包括HIF-1信号通路、脂肪细胞因子信号通路、胰岛素抵抗、AGE-RAGE信号通路、TLR信号通路、VEGF信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、GnRH信号通路、2型糖尿病、PI3K/AKT信号通路等。这些信号通路在骨骼肌肉系统网络中会产生交互作用。缺氧时，HIF-1α表达增加，内皮细胞中HIF-1α信号传导诱导H型血管增生，促进软骨内血管生成和成骨细胞增殖，使骨量增加［26］。VEGF是重要的血管生成刺激因子，参与外周血源性间充质基质细胞介导的新生血管形成和组织再生［27］。基于VEGF信号通路和血管生成的治疗方案可显著减轻OP患者的疼痛并促进骨骼、肌肉生长。VEGF可调节成骨细胞和破骨细胞活性，异常VEGF信号转导可引起软骨变性、骨赘形成、骨硬化症及过度的炎症反应［28］。

研究表明，AGEs与肌肉和血管中的RAGEs结合，导致炎症、血管内皮功能障碍、血管钙化和骨骼肌血流病理改变，加速动脉粥样硬化斑块及血栓的形成，进而导致肌肉减少、肌肉功能减退及骨量流失［29］。PI3K/AKT信号通路在骨代谢及骨骼肌的萎缩、肥大过程中扮演重要角色，上调AKT1表达不仅可以促进萎缩肌肉恢复，还能通过调节骨折端的应力刺激及促进成骨分化，加速骨折愈合［30］。TLR信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路皆为重要的炎症信号通路，本课题组前期研究结果表明，壮骨方可调节低度慢性炎症、胰岛素抵抗及脂肪代谢［4-5］。

综上所述，壮骨方活性成分可通过多靶点、多通路干预成骨细胞、破骨细胞及成肌细胞分化，调节骨骼肌代谢合成过程，具有减轻氧化应激、促进血管重建及内皮再生等多种治疗作用。本研究运用网络药理学方法预测壮骨方治疗SOP的作用机制，并进行分子对接试验验证，为壮骨方药理机制相关后续研究提供了依据。然而，中药复方活性成分与疾病靶点的相互作用机制复杂，尚需更多的基础研究验证以上结论。