ANRIL在动脉粥样硬化发病机制及临床应用中的研究进展

李成城 曹海涛 吴奇勇

ANRIL为激酶4抑制因子(INK4)基因座中反义非编码RNA，又称CDKN2B-AS，为CHD的遗传易感基因[1]。而动脉粥样硬化(AS)是造成CHD发病的主要病因，ANRIL与动脉斑块的形成和迁移、血管狭窄和闭塞等病理过程密切相关[2]，本文旨在探讨ANRIL在AS形式过程中的作用机制和临床意义。

1 ANRIL的概述

ANRIL位于Chr9p21，起源于INK4b-ARF-INK4a基因的反向转录，也是CHD公认的“高风险位点”，它由外周血单核细胞(PBMC)中的CHD风险单核苷酸多态性(SNP)rs1333049诱导逆转录产生，拥有多种异构体及剪切转录本，而且它们的功能与特性各不相同[3]。CHD发病率明显受到ANRIL异常表达的影响，且SNP与CHD呈直接相关性(例如rs6475606、rs10757274和rs2383206)。ANRIL有环形和线性两种异构体，线性ANRIL可促进表观遗传蛋白复合物的产生，构建AS的分子支架；而环状ANRIL(circANRIL)通过控制核糖体RNA加工和蛋白质翻译，对AS的发展起抑制作用[4]。在AS的发病中，ANRIL的线环比例尚未得知，但目前可以确定的是它们有着相同的序列，通过顺式和转基因共同参与AS的发病。

2 ANRIL影响AS的机制

2.1 加剧炎症反应 ANRIL是调控内皮细胞(EC)损伤、激活血管内皮生长因子(VEGF)和炎症因子的关键点。EC经常作为AS发病的“扳机”，它是促进缺血性血管生成的关键细胞。EC中ANRIL的异常表达可通过TNF-α-NF-κB-ANRIL/YY1-IL6/8信号通路上调Caspase募集结构域蛋白8(CARD8)表达，加速内皮损伤，加重血管炎症[5-6]。VEGF与稳定且功能正常的血管网络密不可分， ANRIL可通过激活NF-κB、NF-miR-B两条信号通路，改变VEGF的表达[7]。ANRIL通过重新激活pRC2或p300，调节miR-200b的表达，从而影响VEGF的水平[8]；CARD8是影响心血管疾病中炎症的重要成分，ANRIL与CARD8呈正相关[9]，可抑制Caspase-1依赖的IL-1β的分泌和NF-κB的激活，加快炎症反应进程。长链非编码RNA(lncRNA) ANRIL/miR-125a轴与促炎细胞因子呈直接正相关，并直接影响炎症程度[10]；在circANRIL的转基因大鼠中，血清炎症标志物IL-1、IL-6、基质金属蛋白酶(MMP-9)、CRP和Caspase-3等水平显著增加[11]。由此可见，ANRIL可加剧炎症反应。

2.2 作用于平滑肌细胞 血管中斑块形成后，其迁移受血管平滑肌细胞(VSMC)的影响。ANRIL可作为分子支架促进WDR5和HDAC3的结合，形成复合物后通过组蛋白修饰调节NOX1表达，上调活性氧(ROS)水平，促进VSMC表型转变[12]。ANRIL可与SUZ12结合，介导组蛋白H3在H3K27上甲基化从而沉默p15(INK4)，促进VSMC的增殖和迁移[13]。也有学者发现B细胞淋巴瘤/白血病-2相关蛋白A1(BCL2-A1)及钙粘连蛋白5(CDH5)可能是影响VSMC增殖和凋亡过程中的关键蛋白[14]。 ANRIL与其他非编码RNA之间的相互调控也起到至关重要的作用。Tan等[15]通过荧光素酶实验确认过表达ANRIL可直接靶向miR-181a/Sirt1，增加VSMC活力，抑制衰老；ANRIL转录物可通过激活NF-κB途径直接调节VSMC的增殖和凋亡[16]。因此，ANRIL对VSMC的调控作用已得到证实。

2.3 作用于DNA和RNA DNA损伤反应与AS发病密切相关(包括DNA损伤及修复、细胞周期进程、细胞凋亡)。Gray等[17]证实，ANRIL可激活DNA损伤共济失调-毛细血管扩张突变激酶，继而引发双链DNA断裂，促进AS斑块的进展和不稳定性。有学者证实ANRIL通过招募Polycomb蛋白抑制肿瘤抑制因子 p16 (CDKN2A) 和 p15 (CDKN2B)的转录[13]，而p15、p16可抑制成视网膜母细胞瘤蛋白 (pRb)通路，pRb是细胞周期的负调节因子[18]，因此ANRIL可能通过细胞周期的改变来影响DNA复制[19]。ANRIL可作为竞争性内源RNA(CERNAs)或microRNA海绵。Zeng等[20]发现，过表达ANRIL可抑制miR-449a/miR-99a激活周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)，从而促进血管生成和血栓形成；Chai等[21]也发现，在H2O2诱导的凋亡细胞模型中，抑制ANRIL表达可通过靶向miR-125a，下调p53和抑制内在的凋亡途径显著减轻H2O2诱导的细胞损伤。此外，还有一项研究阐明了ANRIL可以靶向miR-181b来控制CHD细胞的增殖和凋亡，诱导NF-κB信号的激活和刺激炎性生物标记物的释放[16]。

2.4 作用于糖脂代谢 血糖、血脂的失调是AS的高危发病因素。AdipoR1、VAMP3和C11ORF10是人们熟知的促糖脂代谢的受体，Bochenek等[22]发现，在HEK 293细胞中过度表达ANRIL后，上述3种受体均呈现出过表达。而Sun等[23]对其具体的机制进行了进一步探索，他们发现可能存在的信号通路为ANRIL-AdipoR1-AMPK/SIRT1，此条通路影响葡萄糖的摄取率，最终影响糖脂代谢效率。此外,Aguilar等[24]还发现ANRIL-p16INK4a-CDK4-pRb轴也可调控脂肪细胞分化、代谢，而CDK4的激活控制住了脂肪细胞的分化、克隆扩张[25]。不仅如此，ANRIL的风险SNP可显著影响人类胰岛中的位点基因表达、胰岛素分泌或B细胞增殖[26]。因此，ANRIL表达失调后可以通过多种途径影响糖脂代谢受体并导致糖脂代谢紊乱，加速AS的发展。

3 ANRIL在临床的应用

3.1 诊断价值 ANRIL的诊断价值在多项临床试验中显现。Hu等[2]对比了230例受试者的临床数据及ANRIL表达水平，发现ANRIL在CHD病人中显著升高，其表达量与斑块数量呈正相关，可作为CHD的诊断标志物，并在随访中发现ANRIL与生存率呈负相关。circANRIL可以诱导核仁应激和 p53 激活[27]，是新近发现的CHD新型诊断标志物[28]。不同地域的ANRIL SNP也不相同：一项纳入了1000例受试者的研究，发现在印度北部地区，ANRIL SNP rs1333049 与CHD发病相关，且发病人群更倾向于肥胖男性[29]；而在伊朗地区，与CHD发病相关的则为 rs10757278和rs1333049[30]；在中国，Yang等[31]对1100例脑梗死及心肌梗死病人的外周血进行ANRIL检测，发现rs2383207和rs1333049与CHD发病风险有显著相关性；Cheng等[32]研究发现，ANRIL rs10965215和rs10738605增加了心肌梗死的易感性，可借此提高诊断心肌梗死的准确率。

3.2 预测预后价值 ANRIL有助于改善CHD风险分层或更好地监测治疗反应或疾病复发。一项临床试验纳入了414例经皮冠状动脉介入治疗的心肌梗死病人，检测冠状动脉再灌注后4个月外周血中5种LncRNAs的表达，通过单因素分析发现ANRIL是左心室功能不全(射血分数<40%)的预测因子[33]。Zhuang等[34]发现 ANRIL SNP (rs10757274) 与 CHD 的发展密切相关，他们招募了 95 名 CHD 病人与110 名健康者对比，发现 ANRIL SNP与罪犯血管的数量增加有关(OR=2.55，P=0.042)。因此，将ANRIL作为预测疾病预后因子，可提高病人生存期和生存质量评估的准确性。

3.3 治疗价值 ANRIL作为CHD发病的关键一环，牵涉了众多影响凋亡、衰老的通路，为未来在基因层面上的治疗提供了可能。ANRIL可通过调节IL-33/ST2轴减轻急性心肌梗死中的心肌细胞凋亡，小鼠活体实验也证实，干扰ANRIL表达可提高心肌梗死小鼠的生存率[35]；在小鼠中过表达ANRIL后构建心肌梗死模型，发现小鼠分离的心脏中Akt磷酸化和eNOS磷酸化的水平增加，作者推测，冠状动脉在缺血条件下血管狭窄的形成和损伤关键途径是ncRNA-ANRIL/Akt/eNOS，这也是未来改善预后的靶点[36]；抑制ANRIL外显子rs10965215和rs10738605的异变可改善心肌梗死病人预后[32]；二甲双胍可上调lncRNA-ANRIL激活AMPK，阻碍AS斑块的发展[37]；在AS中，以circANRIL为治疗靶点可以减少血管内皮损伤、氧化应激和炎症[38]；在糖尿病大鼠中，下调ANRIL可改善心脏功能指数和炎症因子的表达，改善心肌组织的病理状态和心肌重塑，降低糖尿病大鼠心肌胶原沉积面积和心肌细胞凋亡，降低心肌组织的氧化水平[39]。

总之，CHD导致的死亡几乎占全球死亡人数的1/3，这归咎于环境和遗传因素的相互作用，其中ANRIL的表观遗传学改变在AS的发生发展中具有重要意义，可通过EC、VSMC、VEGF等多种细胞及因子影响炎症及凋亡进程，引起一系列病理生理反应，这为临床治疗和预后提供了进一步的可能。ANRIL在AS及CHD的发生发展中，作用已经明确，但在未来，我们需要探索更详细的机制通路，并以此为介入点，从遗传学及基因学层面，降低CHD的发病率，提高病人生存率。