选择性多聚腺苷酸化在心血管疾病中的研究进展

李晓庆 黄菁菁 季军 高伟 鲁翔

选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation，APA)作为一种mRNA转录后水平的调控机制普遍存在于真核生物中。mRNA成熟的重要步骤之一即前体mRNA(pre-mRNA)在3′非编码区(3′UTR)的多聚腺苷酸化位点进行核内剪切并添加一个多聚腺苷尾[poly (A)尾]。大多数人类基因在3′UTR具有一个以上的多聚腺苷酸化位点，这些位点的交替使用可生成具有不同3′UTR长度的mRNA异构体[1]。通过APA机制产生多种mRNA异构体的同时也改变了其3′UTR区含有的顺式调控元件，因此可导致产物受到microRNA、RNA结合蛋白(RNA-binding protein，RBP)等不同反式作用因子的调控，如较长3′UTR的mRNA转录可能具有更多的miRNA和RBP的结合位点，促进mRNA的降解，进而影响mRNA的稳定性和翻译效率。这些都在一定程度上增加了不同组织中遗传信息从DNA传递至蛋白质的复杂性，使得生物体产生多种不同的生理病理功能[2]。

近些年来研究表明APA模式是具有组织特异性的，如大脑中的mRNA通常具有较长的3′UTR，而睾丸中的mRNA具有较短的3′UTR[3]。此外APA还参与了疾病的发生发展过程，如3′UTR在肿瘤发生和T细胞扩增过程中的增殖阶段会缩短，而在分化和发育过程中会延长[4]。心血管疾病是包括一系列涉及心脏、血管(动脉、静脉、微血管)的疾病，目前仍然是全世界最主要的死因之一。近些年APA在心血管疾病病理生理进程中的调控作用也被逐渐证实。一些研究发现，APA参与调控了包括心脏发育、动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)、心肌肥厚(cardiac hypertrophy，CH)和心力衰竭(heart failure，HF)等多种心血管疾病的病理生理过程。本文将从APA的调控因子和机制出发，试对其在心血管疾病中的作用进行综述。

1 APA调控因子和机制

APA调控因子包括切割及多聚腺苷酸化特异因子(cleavage and polyadenylation specificity factor，CPSF)，切割激活因子(cleavage-stimulating factor，CstF)，RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase, RNAP Ⅱ)和RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)等。在mRNA转录延长的过程中，CPSF和CstF结合在RNAP Ⅱ上，促进mRNA 3′UTR的加工修饰[5]。CPSF复合体通过CPSF-30中的锌指结构以及WDR33(WD repeat-containing protein 33)中N端富含赖氨酸/精氨酸的模体, 识别并结合于mRNA 3′端相对保守的多聚腺苷酸化信号位点AAUAAA[6]；同时，CstF复合物通过CstF-64亚基中的RRM结构域, 识别并结合在下游富含GU/U的DSE区。以上两个过程共同参与了多聚腺苷酸化位点的选择[7]。随之，poly(A)信号(PAS)上游20 nt处的UGUA序列招募切割因子(cleavage factor，CF)，CF在PAS下游10～30 nt处进行切割，然后多聚腺苷酸化聚合酶(PAP)编码poly(A)尾巴完成mRNA的多聚腺苷酸化[8]。

许多蛋白因子不仅作为选择性剪切和多聚腺苷酸化的参与者，也作为调控因子参与到APA的调控机制中。例如，Nudt21编码的切割因子CFIm25亚基能够优先选择远端的PAS，然而当其表达下调时则会选择近端的PAS，从而影响了APA事件的发生。同时CFIm25还能通过APA偶联染色质信号的调节影响细胞的命运[9]。不同类型的PAP负责编码poly(A)尾的同时，在PAS的选择和基因表达方面也发挥了一定的作用[10]。多聚腺苷酸结合核蛋白1(PABPN1)作为多聚腺苷酸化中普遍存在的蛋白质，能够作用于PAP并增强其编码poly(A)尾的能力。同时PABPN1可以控制poly(A)尾的长度在250 nt以内，并且PABPN1会优先选择作用于远端的PAS。但是,如果下调PABPN1的表达，多聚腺苷酸化就会优先发生在较不经典的近端PAS[11]。此外,还有像CPEB1、Nova这样的反式作用因子也可通过调控APA机制改变相应致病基因的3′UTR长度，从而参与到疾病的发展过程中[12]。

2 APA在心血管系统中的研究

2.1 APA与心脏发育 心脏是胎儿体内第一个有功能的器官, 心脏发育是一个复杂的形态发生过程，它同时受到遗传和表观遗传机制的调控, 但遗传学已不足以解释心脏发育的病理生理进程[13]。近些年来，越来越多的研究证实APA机制在心脏发育进程中发挥重要作用。Blech-Hermoni等[14]发现CELF1(CUG-BP, Elav-like family member 1)是一种高度保守的RNA结合蛋白，调节pre-mRNA的选择性剪接、聚腺苷化、mRNA稳定性和翻译。在心脏中，CELF1在心肌中表达，其水平在发育过程中受到严格调控，且在胚胎发生期间CELF1表达水平在心肌中达到峰值，这提示了CELF1通过APA机制在心脏发育进程中发挥重要作用。Qian等[15]的研究发现心脏转录因子Nkx2-5可以抑制miR-1的表达水平，而miR-1负调控心脏发育相关蛋白Cdc42的表达水平，因此Cdc42与Nkx2-5对心脏发育有协同作用。Nimura等[16]的研究进一步发现在心脏发育进程中，同源蛋白Nkx2-5和5′-3′外切酶Xrn2通过参与APA的调节发挥独特的作用。Nkx2-5通过将Xrn2招募到靶向基因区域来调控APA, Xrn2具有5′-3′核酸外切酶活性并有助于基因末端的转录终止。Xrn2与mRNA抑制因子结合到转录起始位点(transcription start sites, TSSs)和其他下游区域，并参与RNAP Ⅱ延伸的调控。Nkx2-5缺失影响Xrn2与靶基因位点的结合，这不仅可以导致RNAPⅡ的占用增加，而且可以促进心脏发育相关基因长3′ UTR的mRNA表达增加[17]。APA调控过程还可以促进机体产生必要数量的心肌蛋白，例如由Tnnt2和Atp2a2编码的心肌肌钙蛋白T(cTnT)。cTnT的组成部分是肌节组装所必需的，对维持正常的心脏功能至关重要，这也间接提示了APA机制对心脏发育的重要作用[18]。

2.2 APA与AS AS是一种缓慢的、进行性的心血管疾病，其中炎症反应在AS斑块形成以及斑块不稳定过程中起重要作用。由于NLRP3炎症小体可诱导促炎细胞因子IL-1β和IL-18产生，从而成为AS等许多常见炎症性疾病的有力驱动因素[19]。Tristetraprolin(TTP)是锌指蛋白36同源物，具有抗炎、抗肿瘤的作用，其表达减少会加剧AS的进展[20]。2017年，Haneklaus等[21]发现调节NLRP3表达的新的转录后机制，NLRP3基因转录后可通过APA生成两种mRNA转录本(一种3′UTR约为600 bp，另一种约为300 bp)，并且短3′UTR的稳定性优于长3′UTR。接着，他们经过实验发现了TTP通过结合于长3′UTR上富含AU的序列(AU-rich elements, ARE)，可以抑制NLRP3炎性小体的表达，提示APA机制在AS进程中具有重要的作用。

2.3 APA与CH CH的病理特征是心脏前后负荷的增加导致心肌细胞增大，随着压力负荷的持续，最初的适应性肥大反应是有益的，因为它可以维持心脏正常的功能，然而持续的心肌细胞功能障碍会导致心肌收缩力受损，引起不可逆的心脏结构重塑[22]。有研究表明，编码“促肥大”和“抗肥大”蛋白的各种基因可以通过改变其mRNA 的3′UTR来调控自身的蛋白表达水平。APA模式发生的变化会影响3′UTR区的长度，从而改变心脏肥大过程中几种蛋白调节剂的表达[23-24]，如NAD(P)H: 醌氧化还原酶1[NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1, NQO1]，非规范性聚合酶(speckle targeted PIPKIαregulated poly(A)polymerase，Star-PAP]，RNA结合基序蛋白10(RNA binding motif protein 10，RBM10)等。

Kumar等[25]发现NQO1负责编码NQO1蛋白，其作为一种抗氧化酶在心肌细胞的保护中起着重要的作用，并且NQO1表达的改变也参与了CH的病理进程。Star-PAP作为一种特异性poly(A)聚合酶，通过对poly(A)位置的选择参与了APA调控，其敲除后会导致3′UTR的缩短或延长。Kandala等[26]发现Star-PAP可以与多聚腺苷酸化聚合酶α(PAPα)竞争结合CPSF-160，但Star-PAP的竞争性更强，更容易与CPSF-160形成复合物，并结合于CH相关基因NQO1的特殊poly(A)位点，进而介导APA调控其表达，从而参与CH的进程。Star-PAP的优势不仅仅在于和CPSF-160的结合，还在于：靶mRNA 3′UTR的PAS上游有一段-AUA-模体以及富含GC的序列，这样的顺式作用元件能够被Star-PAP特异性识别，使其抢占poly(A)位点；靶mRNA 3′UTR的PAS下游的DSE段U含量低，能够阻碍CstF-64的识别与结合，而Star-PAP发挥作用并不需要CstF-64。总而言之，Star-PAP通过识别靶基因的特定poly(A)结合位点，介导APA参与调控的CH。研究发现，RBM10作为一种RNA结合蛋白和RNA剪接因子，可在一定程度上协助Star-PAP的功能以调节CH涉及的关键基因。RBM10上的RRM2结构域能够与Star-PAP催化结构域结合形成复合物，并结合于mRNA的 3′UTR上，并通过APA事件调控“抗肥大”调节因子的表达。有研究证明，不能与Star-PAP结合的RBM10缺失突变体(RRM2结构域缺失)不能挽救异丙肾上腺素治疗引起的细胞肥大和相关分子事件，这说明RBM10作为一种重要的“抗肥大”调控因子能够与Star-PAP协同抑制心脏肥大[27]。

2.4 APA与HF HF是心血管疾病的主要表现形式，也是很多心血管疾病的终末状态。HF伴随着心脏内稳态的丢失，这依赖于基因表达的严格调控。APA通过对HF靶基因mRNA 3′UTR的长度进行调控从而参与HF的病理进程，有研究发现衰竭的心脏中基因3′端mRNA的形成发生了变化，但其对于致病的重要性仍然未知。2016年Creemers等[28]使用3′端RNA测序(e3′-Seq)直接测量人类健康和衰竭的心脏标本中APA的整体模式。通过监测这些心脏中的多聚腺苷酸化谱，在众多基因中鉴定了疾病的特异性APA信号，同时该研究还发现许多HF相关基因的3′UTR会相应发生缩短，并且这些基因的作用大多与RNA结合相关，但是3′UTR延长的基因则与细胞骨架以及肌动蛋白结合相关。在更大范围的人类心脏中进行的RNA测序表明，这些可能和APA机制相关的基因通常在衰竭的心脏中差异表达，并且3′UTR的长度与基因表达水平之间呈负相关。他们的研究还发现：在衰竭心脏中，APA调节蛋白PABPN1表达量显著下调，提示PABPN1的下调可能与某些基因使用近端PAS有关。该研究还观察到了CPSF-4表达下调和断裂和聚腺苷酸化因子亚基(cleavage and polyadenylation factor subunit-11， PCF11)表达上调，提示这些APA调控因子在心脏衰竭的进程中起到了潜在作用。但是在衰竭心脏中3′UTR的延长机制还不清楚，有待于后续的实验研究。

3 总结

半数以上的人类基因存在潜在的APA位点，APA的调控影响多种基因的生物学功能，在多种疾病的发生发展中发挥重要作用。近些年来APA在心血管系统中的重要作用逐渐被证实，发现APA在心脏发育、AS、CH和HF等中通过调节mRNA的3′UTR 长度调控相关基因的稳定性和翻译效率，进而调控相关蛋白的表达水平。因此深入研究APA在心血管系统中的调控机制可能有助于寻找心血管系统疾病的潜在治疗靶点，为寻找更为有效的治疗提供理论依据。