TTC染色鉴定葡萄抗寒性方法的优化与应用

王涵雅，李 欣，毛 娟，马宗桓，韦霞霞，陈佰鸿

(甘肃农业大学 园艺学院，兰州 730070)

中国北方的冬季低温会对葡萄生长造成严重影响[1]。多年来，在葡萄对低温信号的转导及其应答机制方面开展了大量研究，以期为葡萄抗寒性评价和抗寒品种选育提供理论依据。低温胁迫会对细胞膜结构造成严重破坏，从而引起电解质外渗、相对电导率增加。通过测定不同温度梯度下植物组织的相对电导率来拟合Logisitic方程，计算出半致死温度(LT50)，可有效预测植物的抗寒性[2]。电导法由于操作简便，已成为目前植物抗寒性评价中使用最广泛的方法之一，在苹果[3]、梨[4]、葡萄[5]等果树的抗寒性鉴定中均得到运用。然而，此法在具体操作时易受浸泡时间、温度以及空气中CO2的溶解等因素的影响，会出现结果重复性较差、与田间实际的抗寒性表现不一致等问题[6]。

氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)是一种显色剂，有活力的细胞可在还原酶的作用下将其还原为一种不溶于水的红色物质三苯基甲臢(triphenylmethylzan，TTF)[7]，显色程度可以用来判断植株的活力大小。TTC染色指数法是根据低温胁迫后植株TTC染色等级对抗寒性进行评估。有学者对低温处理后的橡胶枝条进行TTC染色，将染色级数与田间实际抗寒性进行比较，证明TTC染色级数法准确可靠[8]。目前此法在核桃[9]、杜仲[10]、葡萄[11]等植物的抗寒性评价上也有报道，但仍存在横截面染料堆积、目测数据不准确等问题。赵滢等[12]在葡萄枝条中运用TTC染色法时将观测面由横切面改为纵切面，并利用扫描仪和图片处理软件联用的方法将染色结果进行可视化分析和数据量化，但仍存在染色时间较长、扫描图片不清晰等问题。

单一的生理生化指标往往不能准确反映出植物的实际抗寒能力，因此通常选取多个指标(如可溶性糖、可溶性淀粉、脯氨酸、水分等)进行测定，从而较为全面地反映出植物的真实抗寒水平，准确地对植物抗寒性进行鉴定。常用的综合评价法有主成分分析法和隶属函数法。 已在杏[13]、葡萄[14]和猕猴桃[15]等多种果树中得到应用。范宗民等[16]在对葡萄枝条的抗寒性鉴定中测定了可溶性蛋白、脯氨酸、抗氧化酶等多个指标，所得综合隶属度可以准确反映枝条的抗寒性。但此法在鉴定大量种质时相对费时费力。

鉴于以上情况，我们优化了葡萄枝条TTC染色条件，并选择6个葡萄品种一年生枝条为试材，以低温胁迫后枝段纵切面染色面积为判断标准，结合Logistic方程对其抗寒性进行综合评价；同时与电导法、隶属函数法获得的抗寒性评价结果进行比较，以此来验证用枝段纵切面染色面积拟合LT50进行抗寒性鉴定的可行性和准确性，旨在建立一种简便、可靠的葡萄休眠期抗寒性评价方法。

1 材料和方法

1.1 试验材料

从甘肃省武威市林业科学研究院酿酒葡萄品种园采集 ‘左山1号’、‘黑比诺’、101-14、3309C、140R和SO4 6个葡萄品种和砧木。该区地处河西走廊东端(38°02′32″N，102°42′19″E)，海拔1 632 m，属温带大陆干旱性气候，以沙质土壤为主。年平均温度7.8 ℃，无霜期150 d，年蒸发量2 135 mm，年均日照时数2 725 h。葡萄株行距为0.7 m×3.0 m，浅沟栽植，沟深30 cm，沟宽80 cm，沟长70 m，东西行向，单臂篱架整形，架高1.7 m。

1.2 材料低温处理

于2020年11月上旬采集各品种长势一致的一年生枝各50枝，每枝长40 cm，室外沙藏30 d备用。材料的低温处理参照张倩等[17]的方法，并稍作改动。供试材料表面清理干净后用保鲜膜包裹，添加标签，放入超低温冰箱，分别在0 ℃、-14 ℃、-19 ℃、-24 ℃、-29 ℃和-34 ℃的温度下冷冻，缓慢降温至目标温度后放置24 h，随后缓慢升温到4 ℃后放置8 h，然后于室温下再放置8 h，升降温速率均为4 ℃/h。分别刮取韧皮部与木质部，在液氮中速冻后迅速移至-80 ℃冰箱保存，用于后面生理指标的测定。随机抽取3个枝条为1个处理，重复3次，以0 ℃处理下的材料为对照。

1.3 相对电导率拟合葡萄枝条半致死温度

Y=K/(1+ae-bx)

方程中Y代表相对电导率，a、b是方程参数，K为常数，由于Y是累积频率，此处K取100，LT50即方程拐点，计算方式为：LT50=-(lna/b)

1.4 TTC活力染色面积拟合葡萄枝条半致死温度

1.4.1 葡萄枝条TTC活力染色条件优化选择长势良好和粗细均匀的一年生枝条清洗干净，避开芽眼剪成0.5 cm厚的茎段，取8个放入10 mL离心管中，加入0.5% TTC-0.1 mol/L磷酸缓冲染色液没过枝条。分别在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃下各依次浸泡12、24、36、48、72和96 h，取出后将各浸泡时间枝条纵切，在体视显微镜成像系统下观察染色情况并拍照，确定最佳染色温度和浸泡时间。

1.4.2 葡萄枝条低温胁迫后优化TTC法活力染色为了观察低温胁迫后葡萄枝条的TTC活力染色情况，利用优化的TTC染色条件对1.2中低温梯度胁迫处理后的葡萄枝条进行活力染色，染色后用蒸馏水洗涤3～5次，纵切面在体视显微镜下成像拍照。然后，染色图片用Image J软件进行选定图像的面积统计，在图像选定时避开髓部。

1.4.3 TTC染色面积拟合Logistic方程采用1.3 中电导法拟合Logistic方程的方法，先拟合方程，然后依据Logistic方程计算葡萄枝条半致死温度LT50。

1.5 葡萄枝条韧皮部、木质部生理指标测定及抗寒性综合评价

首先，对1.2中低温梯度处理后的各葡萄品种枝条的韧皮部和木质部的生理指标进行测定。其中，可溶性糖和淀粉含量用蒽酮法测定[19]，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定[19]，脯氨酸含量采用茚三酮比色法测定[19]，总水含量采用烘干法测定，自由水含量采用马林契克法[19]，然后计算出束缚水含量以及束缚水与自由水比例(束自比)。

其次，参照抗寒综合评价模型[20-21]，对6个葡萄品种的韧皮部和木质部进行抗寒性评价。具体公式如下：

Uij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)(正相关)

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或Uij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)(负相关)

式中，U为抗寒隶属函数值，X为各品种不同指标的测定值，Xjmin为j指标的最小值，Xjmax为j指标的最大值，i代表品种，j代表指标。

参照高振等的方法[22]，将葡萄砧木的抗寒性分为以下5个级别：1级，平均隶属度处于0.70～1.00之间的归为高抗寒(high resistance，HR)；2级，平均隶属度处于0.60～0.69之间的归为抗寒(resistance，R)；3级，平均隶属度处于0.40～0.59之间的归为中抗寒性(middle resistance，MR)；4级，平均隶属度处于0.30～0.39之间的归为低抗寒性(low resistance，LR)；5级，平均隶属度处于0～0.29之间的归为不抗寒(susceptible，S)。

1.6 数据统计分析

所有数据均采用Excel 2010进行处理和作图，用SPSS 22.0进行方差分析与相关性分析。相关系数采用Pearson方式进行计算。

2 结果与分析

2.1 TTC染色法确定葡萄枝条低温半致死温度

2.1.1 葡萄枝条TTC染色条件优化由于‘黑比诺’品种的抗寒性最弱，因此用其一年生枝条来进行TTC染色条件的优化。将0.4～0.6 cm枝条用0.5% TTC-0.1 mol/L磷酸缓冲液染色(用水浸泡枝条作为对照)，纵切面染色结果如图1所示，发现染色温度与染色时间均对染色结果有一定影响。用Image J软件将图片进行处理后(图1)可以看出，不同温度下染色面积达到95%以上时的时间有所不同，在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃染色温度下分别为72、72、48、36和36 h，在35 ℃及40 ℃时用时明显较短。尤其是在35 ℃染色36 h后，切面颜色最深且能达到全红。因此，优化获得葡萄枝条的最佳染色条件为：0.5% TTC-0.1 mmol/L磷酸缓冲液在35 ℃下避光染色36 h。

2.1.2 不同品种低温处理后枝条活力比较用优化获得的葡萄枝条最佳TTC法染色条件将不同低温处理过的枝条进行染色。染色结果(图2)显示，在0 ℃条件下，各个葡萄品种枝条染色面积均接近100%，全部染成深红色。在-14 ℃低温处理下，除‘黑比诺’枝条外，其余各品种枝条染色面积也大于90%，从着色程度来看‘黑比诺’枝条染色程度也明显比其他5个品种浅。在-19 ℃低温处理时，‘黑比诺’与140R染色相近，均染色较浅，比其余品种低50%左右。在-24 ℃低温处理时，枝条染色面积从大到小依次为：‘左山1号’、101-14、3309C、SO4、140R和‘黑比诺’。

图2 低温处理后不同品种枝条纵切面的TTC染色结果

2.1.3 TTC染色法确定枝条低温半致死温度由表1可知，用上述方法获得的枝条染色面积来确定葡萄枝条的低温半致死温度(LT50)，拟合度R2最低在0.9264，证明用TTC染色法结合Logistic方程来拟合葡萄枝条LT50是合理的。根据LT50值的大小对6个葡萄品种的抗寒性进行排序，结果表现为：‘左山1号’ > 101-14 > 3309C > SO4 > 140R > ‘黑比诺’。

表1 利用枝条染色面积计算不同葡萄品种的低温半致死温度

2.2 低温胁迫下各品种枝条相对电导率和半致死温度

图3显示，随着处理温度的降低，各葡萄品种枝条的相对电导率均不断升高，均在-34 ℃时达到最大，此时‘左山1号’、‘黑比诺’、101-14、3309C、140R和SO4的枝条相对电导率分别为79.08%、61.89%、66.98%、67.58%、70.18%和73.98%。在整个低温胁迫过程中，‘黑比诺’的相对电导率增幅最大(51.93%)，而‘左山1号’的增幅最低(44.07%)。

图3 低温处理下不同品种葡萄枝条相对电导率

同时，在每一个处理温度下，‘左山1号’的相对电导率始终最低。除-24 ℃处理外，‘黑比诺’的相对电导率均高于同一温度的其余品种。根据“相对电导率变化越大，抗寒性越弱”的标准来判断，6个葡萄品种枝条的抗寒性排序为：‘左山1号’ > 101-14 > 3309C > SO4 > 140R > ‘黑比诺’。这与上述TTC染色法所得各葡萄品种抗寒性顺序一致。

同时，利用相对电导率拟合Logistic方程得出供试材料半致死温度(LT50)可以看出(表2)，6个供试材料的LT50在-31 ℃～-17 ℃之间，决定系数均较高，证明用不同温度下的电解质渗出率来拟合半致死温度是合理的。根据“LT50越小，抗寒性越强”的标准判断，6个葡萄品种抗寒性排序表现为‘左山1号’ > 101-14 > 3309C > SO4 > 140R > ‘黑比诺’，他们的LT50值分别为：-30.02 ℃、-26.40 ℃、-25.75 ℃、-23.16 ℃、-21.13 ℃和-17.72 ℃。

表2 利用相对电导率计算不同葡萄品种的低温半致死温度

2.3 低温胁迫下各葡萄品种枝条抗寒性的隶属函数法综合评价

6个葡萄品种间抗寒性不同，同一品种不同部位抗寒性也有所差异，每一个葡萄品种韧皮部隶属函数值均大于其相应木质部(表3)。其中，品种101-14、3309C和140R韧皮部的抗寒等级分别为高抗寒、高抗寒和低抗寒，而这3个品种的木质部抗寒等级也有所不同，分别为抗寒、抗寒以及不抗寒。‘左山1号’、SO4和‘黑比诺’这3个品种枝条木质部和韧皮部的隶属函数值不同，但抗寒等级相同，均分别为高抗寒、中抗寒和不抗寒。无论韧皮部还是木质部，各品种隶属函数值从大到小都依次为：‘左山1号’、101-14、3309C、SO4、140R和‘黑比诺’。

表3 基于隶属函数综合评价不同品种葡萄枝条的抗寒性

2.4 不同抗寒性鉴定方法之间的相关性分析

运用TTC染色指数和相对电导率分别求得的低温半致死温度与枝条韧皮部、木质部的综合隶属函数值之间的相关性如表4所示，不同的抗寒性评价方式所得结果之间均达到极显著相关。通过TTC染色面积和相对电导率求得的低温半致死温度相关系数高达0.983。枝条韧皮部和木质部抗寒性有所差异，但不同部位求得的平均隶属度呈极显著正相关，相关系数为0.987。TTC染色面积拟合LT50与韧皮部和木质部的隶属函数值均为极显著负相关，相关系数分别为-0.938和-0.945。

表4 半致死温度与隶属函数法综合评价结果的相关性分析

2.5 低温处理对枝条生长恢复的影响

低温处理后扦插枝条的萌芽率和生根率均能够有效的反应植物的耐寒能力。如图4所示，随着处理温度的降低，各个品种的萌芽率和生根率均降低。0 ℃是6个品种的萌芽率和生根率均接近100%。在-24 ℃下，‘左山1号’和101-14的萌芽率和生根率均高于50%，而140R和‘黑比诺’的生根率和出芽率均低于40%。温度继续降低至-29 ℃时，‘黑比诺’的萌芽率和生根率均为0，140R的萌芽率低至8%而生根率为0，而‘左山1号’的生根率和萌芽率还在50%作用。当处理温度为-34 ℃时，‘左山1号’生根率和萌芽率仍然能达到30%，其余品种的萌芽率和生根率均接近0。从萌芽率和生根率可以明显的看出‘左山1号’的耐寒性高于其他5个品种，而‘黑比诺’的抗寒性低于其他品种。

图4 低温处理后各葡萄品种枝条萌芽率和生根率

3 讨 论

植物细胞因低温伤害受损后，生物膜会被破坏，造成电解质外渗。因此，测定不同低温下电解质渗出率可以了解膜受损程度。用电解质渗出率结合Logistic曲线方程，可对各品种的LT50进行预测，拐点温度可以用来衡量植物抗冻性的强弱，预测结果和田间调查结果基本接近。在本研究中，葡萄枝条相对电导率随着处理温度的降低逐渐增大，增幅越大，抗寒性越弱，反之则越强；同时，LT50越大，表明抗寒性越弱。因此，利用上述方法得出了6个葡萄品种的抗寒性排序为：‘左山1号’ > 101-14 > 3309C > SO4 > 140R > ‘黑比诺’，部分品种抗寒性排名与刘钰玺等[23]的研究结果一致。

TTC染色法能简单快速地检测出超低温保存中茎尖的活力，并且在生产中能用TTC法测定种子的生活力来判断种子潜在的发芽能力和种子质量[24]。由于染色温度和时间均会对染色结果有所影响，在植物枝条中应用TTC染色法的基础上，优化并获得了葡萄枝条的最佳染色条件，并结合Image J软件将TTC染色面积量化分析，发现用染色面积拟合Logistic方程获得的拐点温度与相对电导率拟合的LT50之间的相关系数较高(0.983)，表明此方法在葡萄枝条的抗寒性鉴定方面准确性较高，这一研究结果与赵滢等[12]的研究结果相一致，类似结果在橡胶树[8]、板栗[25]等树种上均得到了验证。进一步利用此法获得的不同葡萄品种枝条的抗寒性排序与根据电导法得到的抗寒性结果一致，再次证明TTC染色法结合半致死温度来评价葡萄枝条抗寒性具有直观可靠等优点。

植物在面临低温时，其机体内保护物质会增加。在低温胁迫下苹果砧木的电导率会升高，伴随丙二醛、可溶性糖、游离脯氨酸含量会骤然增加[26]。单一指标衡量葡萄枝条抗寒性具有一定局限性，根据报道通过多个指标结合模糊隶属函数法来综合评价抗寒性更加合理[27]。本研究通过模糊隶属函数法获得的隶属值从高到低依次为：‘左山1号’、101-14、3309C、SO4、140R和‘黑比诺’，与通过电导率和TTC染色法确定的抗寒性排序结果一致。另外，本研究利用综合隶属函数法对葡萄枝条不同部位进行抗寒性评价，发现韧皮部的抗寒性强于木质部，这可能是因为木质部中的细胞间隙大于韧皮部，通透性较强，且韧皮部代谢能力发达， 所以韧皮部对低温的抵抗能力强于木质部。

4 结 论

本研究以6个葡萄品种枝条为材料，在对TTC染色法的染色温度和染色时间进行优化的基础上，采用优化的TTC染色枝条纵切面积拟合半致死温度得到不同葡萄品种枝条的抗寒性，其抗寒性排序与电导法拟合半致死温度、生理指标综合隶属函数综合评价法获得的结果一致。与其他方法相比，改良的TTC染色面积拟合半致死温度能更加直观和准确地预测葡萄枝条的抗寒性。