杂交兰花瓣类黄酮成分分析及其对花色的影响

孔 兰，林榕燕，樊荣辉，林 兵，方能炎，钟淮钦*

(1 福建省农业科学院 作物研究所, 福州 350013; 2 福建省特色花卉工程技术研究中心, 福州 350013)

杂交兰(Cymbidiumhybrid)通常指兰属中大花蕙兰与国兰种间杂交培育而成的一类兰花，其兼具了亲本的‘色、香、韵、姿’。该杂交种适应性强，具有发芽性好，易开花、耐热性好、抗性较强、易规模化生产等特点，深受消费者和商家的追捧和喜爱，具有广阔的开发和应用前景[1-2]。目前，国内外关于它的研究多集中于栽培技术[3-4]、组织快繁[5-6]、花芽分化[7]、香气成分测定[8]和叶艺理化与分子生物学研究[9-12]等方面。

花色决定了杂交兰的观赏价值和经济价值，开发新型花色是杂交兰育种的主要目标之一，也是古往今来研究的焦点[13]。研究表明，植物花色主要由3类物质决定：类黄酮、类胡萝卜素和生物碱，其中类黄酮又包括花青素、黄酮(醇)、二氢黄酮(醇)、异黄酮、黄烷酮、查尔酮等化合物[14-15]。花青素是主要的显色物质，呈现出红色、橙红色、蓝紫色；其余黄酮类化合物为辅助色素，呈现出白色、黄色、浅黄色[16-18]。常见的杂交兰花色有白色、黄色、红色、绿色及复合色[2]。但关于杂交兰花色素的研究相对较少，仅见对部分品种色素含量或花青素苷成分的分析[1,19-20]。因此，研究杂交兰花色素类型和组分对其新花色品种的培育具有重要意义。本研究通过颜色特征反应、紫外-可见光谱分析和靶向代谢组学方法，对7个杂交兰品种的花色素类型、组分和含量进行了研究，初步分析了杂交兰花色形成的不同组分及其花色差异原因，以期为品种花色改良和育种工作提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

7个杂交兰材料为黄色系‘双艺雅凤’和‘玉凤’，红色系‘香兰’、‘樱花’、‘红宝石’、‘福韵红霞’和‘红贵妃’(图1)，均保存于福建省农业科学院作物研究所花卉研究室特色兰花种质资源圃中。

A.双艺雅凤；B.玉凤；C.香兰；D.樱花；E.红宝石；F.福韵红霞；G.红贵妃

于盛花期采集盛开的花朵，每个样品分别取3株混合，以铝箔纸包裹，部分液氮速冻后置于-80 ℃保存备用，一部分于-20 ℃冷存备用。

1.2 方 法

1.2.1 花色素类型的定性分析将7个品种盛花期花瓣经液氮充分研磨后，各取0.2 g粉末加至含有5 mL石油醚、10%盐酸溶液和30%氨水溶液的三角瓶中，4 ℃静提24 h，观察并记录颜色变化[21]。

1.2.2 类黄酮的显色反应取新鲜花瓣各0.5 g左右，剪碎，放置于50 mL三角瓶，加入20 mL 1.0%盐酸甲醇溶液(浓盐酸∶甲醇=1∶99)，4 ℃静置提取60 h，过滤，定容至25 mL。各取2 mL提取液进行下列颜色反应。1)浓盐酸-锌粉反应：加入少量锌粉和10滴浓盐酸(约500 μL)，混匀，静置1 h；2)浓盐酸-镁粉反应：加入少量镁粉和5滴浓盐酸(约250 μL)，混匀，静置1 h；3)三氯化铝反应：加入2 mL 1.0% AlCl3·6H2O甲醇溶液，混匀；4)浓硫酸反应：缓慢加入1.5 mL浓硫酸溶液，混匀，沸水浴5 min；5)碱性反应：加入3 mL 5.0% Na2CO3溶液，混匀，密闭静置30 min，然后通气10 min；6)硼酸反应：依次加入10滴1.0% H2O2C4·2H2O溶液和3 mL 2.0% H3BO3溶液，混匀[22]。

1.2.3 紫外-可见光谱分析取新鲜花瓣各0.5 g左右，剪碎，放置于50 mL三角瓶中，加入20 mL 80%丙酮溶液，4 ℃静置提取60 h，过滤，定容至25 mL。分别取甲醇提取液和丙酮提取液，在200～700和400～700 nm扫描，1.0%盐酸甲醇溶液和80%丙酮溶液为相应的空白对照。类胡萝卜素的特征吸收峰出现在440和470 nm附近；花青素的特征吸收峰出现在530 nm附近；类黄酮的特征吸收峰出现在240～285和300～550 nm附近[22-23]。

1.2.4 代谢组分析对冷冻干燥后的样品进行研磨，取0.1 g粉末溶解于1.2 mL 70%甲醇溶液中，每隔30 min旋转30 s，重复6次后置于4 ℃冰箱过夜；离心、过滤，取上清液用于UPLC-MS分析。

使用UPLC-ESI-MS/MS系统(UPLC，日本SHIMADZU公司，Nexera X2；MS，美国Applied Biosystems公司，4500 Q TRAP)分析样品提取物。所用色谱柱为SB-C18色谱柱(美国Applied Biosystems公司，1.8 μm×2.1 mm×100 mm)。流动相A：0.1%甲酸纯水溶液；流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液；洗脱梯度：以95% A相和5% B相为起始，9 min内B相线性增加至95%，A相降至5%，此状态维持1 min，随后1.1 min内B相降至5%，A相增加至95%，维持2.9 min；流速为0.35 mL/min，柱温为40 ℃；进样量为4 μL。使用三重四极杆线性离子阱质谱仪，通过三重四级杆质谱的多反应监测模式(MRM，multiple reaction monitoring)进行质谱数据采集。离子流参数：离子源为涡轮喷雾；源温度550 ℃；离子喷雾电压+5500 V/-4500 V；离子源气体Ⅰ(GSⅠ)，气体Ⅱ(GSⅡ)和帘气(CUR)压力分别设置为50、60和25.0 psi[24]。

1.2.5 数据处理基于福州贝瑞思生物科技有限公司自建数据库和二级谱信息进行物质定性分析，然后利用MRM模式完成代谢物定量。通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度(CPS)，用MultiaQuant软件打开样本下机质谱文件，进行色谱峰的积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积(Area)代表对应物质的相对含量，最后导出所有色谱峰面积积分数据。为了比较代谢物在不同样本中的物质含量差异，根据代谢物保留时间和峰型的信息，对相应的质谱峰进行校正，并将数据导入R软件进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。基于OPLS-DA结果，采取变量重要性投影(variable importance in projection)VIP≥1结合差异倍数fold change≥2和fold change≤0.5(3个生物学重复)的标准筛选不同品种间差异显著的代谢物；利用KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库对差异显著代谢物进行注释和通路富集分析[25-26]。

2 结果与分析

2.1 杂交兰花色素定性分析

石油醚测试结果(表1)显示，7个杂交兰品种的提取液均表现出无色，表明这些品种花瓣中均不含类胡萝卜素。盐酸测试显示，‘福韵红霞’、‘樱花’、‘红宝石’、‘红贵妃’和‘香兰’5个品种的提取液表现出不同程度红色和粉红色，表明其花瓣中含有花青素，且花青素含量存在差异；而‘双艺雅凤’和‘玉凤’的提取液表现出不同程度的黄色，表明其花瓣中不含花青素。氨水测试中，7个品种呈现出铁锈黄或亮黄色，表明所有花中均含有黄酮类化合物(表1)。综上所述，7个兰属杂交种花瓣中均含黄酮类物质，不含类胡萝卜素，除‘双艺雅凤’和‘玉凤’外，均含有花青素。

表1 兰属杂交种花色素类型测试的颜色反应

2.2 类黄酮特征颜色反应

浓盐酸-锌粉反应：黄色系‘双艺雅凤’和‘玉凤’表现出无色，可能含有异黄酮、查尔酮；红色系5个品种呈现不同程度的红色(表2)，说明含有黄酮、黄酮醇和花青素化合物。

浓盐酸-镁粉反应：红色系‘福韵红霞’、‘樱花’、‘红贵妃’、‘红宝石’和‘香兰’表现出不同程度的红色(表2)，说明可能含有黄酮(醇)、二氢黄酮(醇)和花青素苷。

三氯化铝反应：黄色系‘双艺雅凤’和‘玉凤’表现出浅黄色，说明含有黄酮化合物；其他品种表现出不同程度红色(表2)，说明含有花青素苷。

硼酸反应：‘双艺雅凤’和‘玉凤’表现出无色、粉色或浅粉色(表2)，说明黄酮中均不含C5-OH。

浓硫酸反应：‘福韵红霞’、‘红贵妃’和‘红宝石’表现出红褐色，说明含有花青素苷，其他品种表现出不同程度的棕色(表2)，说明含有黄酮(醇)化合物。

碱性试剂反应：‘双艺雅凤’、‘玉凤’和‘香兰’表现出黄色，通气后颜色不发生变化(表2)，说明可能含二氢黄酮(醇)。

表2 不同品种的特征性颜色反应

2.3 杂交兰花色素的紫外-可见光谱分析

紫外-可见光谱分析表明(表3)，7份杂交兰丙酮提取液在440和470 nm附近均无吸收峰，表明这些品种花中不含类胡萝卜素；在甲醇提取液中，7个品种在240～285和300～550 nm处均有吸收峰，表明它们含有查尔酮、二氢黄酮醇等黄酮类化合物；此外，‘福韵红霞’、‘樱花’、‘红贵妃’、‘红宝石’和‘香兰’5个品种的甲醇提取液在530 nm附近具有吸收峰，说明含有花青素苷。该结果(表3)与颜色反应结果相一致，再次证实了7个品种色素成分主要为黄酮类物质。

表3 色素成分的紫外-可见光谱测定结果

2.4 黄酮类代谢物的定性定量分析

以‘玉凤’的黄色花和‘福韵红霞’的红色花为材料，进行了类黄酮代谢组分析，共检测到286种代谢产物(100种黄酮类、100种黄酮醇类、15种二氢黄酮类、14种黄烷醇类、12种花青素类、12种黄酮碳糖苷类、11种查尔酮类、9种二氢黄酮醇类、8种异黄酮类、1种二氢异黄酮、1种橙黄酮、1种原花青素、1种鞣质和1种其他类黄酮)。‘福韵红霞’花瓣中共包含269种代谢物，‘玉凤’花瓣中共包含270种代谢物。总花青素类代谢物在‘福韵红霞’红色花瓣中的相对含量高于‘玉凤’黄色花瓣中的相对含量；总黄酮醇类、黄酮类、二氢黄酮醇类、黄酮碳糖苷类、二氢黄酮类、异黄酮类和查尔酮类代谢物相对含量在‘玉凤’黄色花瓣中均高于‘福韵红霞’(图2)。结果表明，不同花色杂交兰中黄酮类物质的积累方式存在明显差异。

图2 ‘玉凤’和‘福韵红霞’中类黄酮化合物相对含量

2.5 差异代谢物分析

基于OPLS-DA模型的VIP值(VIP≥1)结合fold change(fold change≥2和fold change≤0.5)的方法筛选差异显著的代谢物。与‘玉凤’相比，‘福韵红霞’中共筛选到160种显著差异的代谢物，上调的代谢物有65种，其中矢车菊素-3-O-(2″-O-葡萄糖基)葡萄糖苷是差异倍数最大的上调代谢物；下调的代谢物有95种，其中6-羟基山奈酚-7-O-葡萄糖苷是差异倍数最大的下调代谢物(图3)。在‘福韵红霞’中筛选到了12个花青素苷差异代谢物，除飞燕草素-3-O-(6″-O-咖啡酰)葡萄糖苷外，其余11个代谢物的相对含量明显高于‘玉凤’中的(表4)。其中，7种花青素衍生物(矢车菊素-3-O-(2″-O-葡萄糖基)葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖基芸香糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-(6″-O-对香豆酰)葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷和芍药花素-3,5-O-二葡萄糖苷)是‘福韵红霞’中特有的，它们可能是‘福韵红霞’花瓣呈色的主要色素。在‘玉凤’中，黄酮醇类、黄酮类、二氢黄酮醇类和黄酮碳糖苷类代谢物的相对含量较高。其中黄酮醇类代谢物以异鼠李素衍生物和异槲皮素衍生物为主，包括异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、异鼠李素-3-O-阿拉伯糖苷、槲皮素-7-O-(6″-丙二酰)葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-桑布双糖苷等；黄酮类代谢物主要包括怪柳黄素衍生物和金圣草素衍生物；二氢黄酮醇类代谢物主要包括二氢杨梅素和二氢杨梅素-3-O-葡萄糖苷。此外，‘玉凤’黄色花瓣中有15种代谢物在‘福韵红霞’花瓣中未检测到，其中差异倍数较大的6-羟基山奈酚-7-O-葡萄糖苷、山野豌豆苷(山奈酚-3-O-甘露糖苷)、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷和6-C-甲基槲皮素-3-O-芸香糖苷、棉黄素-3-O-(6″-丙二酰)葡萄糖苷属于黄酮醇类物质。该结果表明这些代谢物种类和含量上的差异可能是导致杂交兰花色差异的关键物质。

图3 ‘福韵红霞’与‘玉凤’的前20位差异代谢物

表4 花青素相关差异代谢物

2.6 差异代谢物的KEGG通路分析

根据差异代谢物结果，进行KEGG通路富集分析。结果显示，差异代谢物共分布在6个代谢通路上，其中花青素生物合成途径与黄酮和黄酮醇生物合成途径富集较为显著(图4)。类黄酮合成途径上代谢物的注释与展示如图5所示。类黄酮合成第1阶段中，香豆酰CoA和丙二酰CoA经过一系列催化酶作用合成查尔酮、柚皮素、圣草酚、五羟基黄酮和二氢山奈酚，在‘玉凤’花瓣中五羟基黄酮经催化后合成了橙皮素(黄酮类)和二氢杨梅素(二氢黄酮醇类)，‘福韵红霞’花瓣中圣草酚经催化后合成了木犀草素(黄酮类)和二氢槲皮素(二氢黄酮醇类)；类黄酮合成第2阶段中，杨梅素、山奈酚和槲皮素的含量在两个品种间无明显差异，‘福韵红霞’花瓣中二氢槲皮素经一系列酶催化合成矢车菊素衍生物和芍药素衍生物，而‘玉凤’花瓣中二氢槲皮素经黄酮醇合成酶催化合成异鼠李素和异槲皮素等槲皮素类衍生物。综上所述，花青素生物合成途径上矢车菊素类代谢产物的积累是‘福韵红霞’花朵呈现红色的主要原因，而黄酮和黄酮醇生物合成途径上槲皮素类代谢产物的积累使‘玉凤’花朵呈现黄色。

图4 差异代谢物的KEGG富集图

红色方框代表该物质上调，绿色方框代表该物质下调，蓝色方框代表该物质无差异

3 讨 论

本研究花色素定性分析中发现7个所试材料花瓣中均含有黄酮类物质，因此进一步利用靶向代谢组学方法对杂交兰花瓣中黄酮类代谢产物进行了分析，共检测到286种代谢产物，分为14个亚组，其中包括100种黄酮醇类和12种花青素类代谢产物。该研究首次提供了杂交兰中参与花色形成的较为完整的代谢产物，而前期研究只强调了花青素在花瓣中的作用[19]。花色素的种类和含量与植物花瓣的最终呈色密切相关[27-28]。本研究中红色系品种‘福韵红霞’含有12种花青素，其中矢车菊素-3-O-(2″-O-葡萄糖基)葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖基芸香糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-(6″-O-对香豆酰)葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷和芍药花素-3,5-O-二葡萄糖苷是红色系品种‘福韵红霞’特有的；黄色系品种‘玉凤’只有5种花青素，除飞燕草素-3-O-(6″-O-咖啡酰)葡萄糖苷外，其余4种花青素代谢产物的相对含量也只有红色系品种‘福韵红霞’中相对含量的1/1130～1/273，暗示了矢车菊素衍生物和芍药素衍生物是红色系杂交兰品种花瓣呈色的物质基础，在花青素代谢途径中以矢车菊素-芍药素代谢分支为主，与前人研究的矢车菊素、飞燕草素和芍药素是兰科植物主要花色素的结果一致[29-30]。同样，在玫瑰[31]、荷花[32]、杜鹃[33]、梅[34]中也证实矢车菊素和芍药素是它们花瓣呈现红色的主要原因。此外，木樨草素衍生物、山奈酚衍生物、芹菜素衍生物等黄酮类代谢产物的含量在‘福韵红霞’中也显著积累，它们可能作为辅助色素，使其颜色加深从而呈现出红紫色。

类黄酮和类胡萝卜素是植物中重要的黄色色素，但黄色系杂交兰品种花瓣中未检测到类胡萝卜素，这表明类胡萝卜素不是使其呈现黄色的主要色素，小苍兰黄花中也发现了类似的结果[35]，但与文心兰[36]和蝴蝶石斛兰[18]黄色花中主要色素为类胡萝卜素不同。研究表明，荷花[32,37]、莲花[38]、金花茶[39]、桔梗[40]中黄色花的形成与黄酮醇有关。本研究中，检测到100种黄酮醇类代谢产物，其中55种黄酮醇类代谢产物的含量在两个品种中差异显著，尤其是异鼠李素衍生物和槲皮素衍生物的相对含量在黄色系品种‘玉凤’中显著高于红色系品种‘福韵红霞’。此外，颜色特征反应和紫外-可见光谱分析结果显示‘玉凤’中不含花青素，代谢组中也仅检测到少量的芍药花色苷和飞燕草素苷。以上结果暗示了槲皮素类黄酮醇代谢物可能在‘玉凤’黄色花瓣形成中具有重要作用。

综合以上结果，本研究发现花青素和黄酮醇生物合成的分流可能是导致红色品种‘福韵红霞’和黄色品种‘玉凤’之间花瓣呈色差异的主要原因。近年来，高通量转录组测序技术已广泛应用于兰属植物的研究，控制花色形成的代谢途径也被阐明。未来的研究可将类黄酮途径上关键差异代谢物与关键基因相结合，深入分析花色形成的分子基础，为兰属杂交种花色育种和定向改良提供理论依据。