老年小鼠慢性痛焦虑模型肠道菌群的变化规律

赵艳 蔡国洪 任牡丹 赵倩 罗妙莎 马文慧 和水祥

焦虑症主要以焦虑情绪体验为特征[1]，主要表现包括无明确客观对象的紧张担心、坐立不安以及植物神经功能失调等症状[2]。老年人更加容易患有焦虑症，且缺少有效和及时的治疗。患有心脑血管疾病、恶性肿瘤和慢性疼痛等疾病的老年人易出现心理障碍问题。因此，对老年人焦虑症的发病机制及治疗方法的研究显得尤为重要。

肠道菌群是胃肠道中抵抗病原体和有害因素的重要系统[3-4]。近年来许多研究发现肠道菌群与焦虑症、抑郁症等精神疾病密切相关[5-6]。研究发现，老年动物会表现出焦虑样行为，但是具体的机制尚不清楚。选择性坐骨神经损伤(SNI)模型是常用的神经病理性痛伴焦虑的模型[7]。本文旨在通过研究老年鼠慢性痛伴焦虑模型的肠道菌群变化，探讨老年焦虑症的病理机制，为进一步改善老年焦虑症的治疗提供理论依据。

1 对象和方法

1.1 对象 本实验采用雄性C57BL/6老年小鼠(16月龄)，为第四军医大学实验动物中心提供的二级清洁动物。随机分为模型组和对照组，每组6只。实验动物饲养符合国家医学实验动物管理标准，室内温度保持在22 ℃～24 ℃，湿度约50%，饲养环境整洁卫生，及时补充水和食物。动物房保持12 h/12 h的昼夜调控，行为学检测在12:00～18:00之间进行。所有实验经空军军医大学动物保护和使用伦理委员会批准(IACUC 20200161)。

1.2 方法

1.2.1 SNI模型建立：腹腔注射浓度为2%戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，充分暴露坐骨神经的三支分支。结扎坐骨神经的腓总神经和胫总神经分支，并在远端剪断。对照(control, CON)鼠仅暴露坐骨神经，不进行神经结扎和剪断操作，术后缝合并消毒切口。

1.2.2 小鼠神经病理性痛模型机械痛敏检测[8]：在SNI小鼠建模后的第21天用Von-Frey 纤维丝检测模型组和对照组小鼠手术侧(左侧)下肢的机械痛阈值。用 Von-Frey纤维丝刺激小鼠的足底，刺激强度为0.04～2.4 g；Von-Frey纤维丝刺激后，小鼠的缩足或者舔足动作视为阳性反应。每种刺激强度各进行5次，如有3次出现阳性反应，则该刺激强度为该小鼠的机械痛阈值。

1.2.3 旷场实验(open field test, OFT)[9]：旷场实验视频采集的时长为6 min，用Smart 3.0 软件分析小鼠在旷场中的运动轨迹。旷场划分为4×4方格，将中央的4个方格定义为中央区域，将四周的12个方格定义为周围区域；最后用Smart 3.0软件统计小鼠在旷场活动的总路程和在中央区域活动的时间。

1.2.4 高架十字实验(elevated plus maze，EPM)：EPM在OFT之后进行，间隔至少1 h。视频采集的时间为6 min，用Smart 3.0软件统计小鼠在EPM活动的总路程和在开臂区活动的时间。

1.2.5 小鼠粪便采集(自然排便法)[10]：将待取便的小鼠放置于无菌的小鼠笼子里自然排便，然后用无菌镊子收集粪便，装入1.5 mL无菌EP管并小心地闭合管盖。将装有粪便的EP管立即放至于-80 ℃冰箱保存，待后续检测。

1.2.6 16S rDNA测序：接收DNA样品以后，对样品的质量进行检测。构建文库：回收目的扩增子片段，用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶将打断形成的黏性末端修复成平末端，再将碱基“A”加到3′端，让DNA片段能与带“T”碱基的接头连接。磁珠筛选目的Amplicon片段，用合格的文库进行cluster制备和测序。

除以上三种类型的指标之外，还有一种“红线”型指标，通常给出目标的最低值或最高值，要求在一定时间段内不能越过边界，常见于环保类指标，如耕地红线等。若当年的实际完成值未超过目标界限，则视当年的年度完成率为20%，否则记为0。若五年内每年都在目标界限内完成，即视为完成五年目标的100%。

2 结果

2.1 2组机械痛阈值及体质量比较 与对照组相比，模型组小鼠左侧下肢机械缩足阈值显著降低(P<0.001)，体质量在21 d后也显著下降(P=0.013)，见表1。提示老年小鼠SNI手术后长期的慢性神经病理性疼痛影响小鼠的正常生活，导致小鼠的体质量降低。

表1 2组机械痛阈值及体质量比较

2.2 SNI小鼠术后21 d焦虑样行为检测 SNI术后第21天，小鼠进入OFT中央区和EPM开臂区的活动时间较对照组明显减少，提示SNI小鼠有焦虑样行为(P<0.01)。模型组和对照组在OFT和EPM的活动总路程没有差异，提示其运动功能没有受影响(P>0.05)，见表2。

表2 2组焦虑样行为检测结果

2.3 肠道菌群检测 将测序的数据与数据库比对，对操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)进行物种的分类。根据物种所占的比例数据，制作每个实验样品在门、纲、目、科这几个等级中不同物种分布的柱状图，并对含量最多的3个物种进行统计分析。

2.3.1 菌群分布的相似性分析：老年小鼠SNI建模手术21 d后OTU重叠的数量较对照组显著降低，提示菌群分布的相似性降低。见图1A，1B。

如果两个样品距离越近，则表示这两个样品的组成越相似。主成分分析(PCA)结果显示，老年小鼠SNI建模手术21 d后与手术前距离很远，提示手术后21 d OTU组成发生了显著的变化。而对照组距离很近，提示对照组小鼠OTU组成没有发生变化。见图1C，1D。

注：(A)对照组手术前后小鼠OTU的Venn图；(B)模型组手术前后小鼠OTU的Venn图；(C)对照组手术前后小鼠OTU的PCA；(D)模型组手术前后小鼠OTU的PCA

2.3.2 门分类水平：在门分类水平，对比丰度最高的3种细菌，结果显示模型组与建模前相比，拟杆菌(P=0.599)、厚壁菌(P=0.489)没有明显变化，而2β-变形菌显著减少(P=0.003)。见图2。

注：**P<0.01

图3 纲分类水平中丰度最高的3种细菌占比

2.3.4 目分类水平：在目分类水平，对比丰度最高的3种细菌，结果显示模型组与建模前相比，拟杆菌和梭菌没有明显变化，乳杆菌显著减少(P<0.05)，见图4。

注：*P<0.05

2.3.5 科分类水平：在科分类水平，对比丰度最高的3种细菌，结果显示SNI模型组与建模前相比，普雷沃氏菌显著减少(P<0.01)，肠杆菌、未归类菌没有明显变化(P>0.05)，见图5。

注：**P<0.01

2.3.6 SNI老年小鼠肠道菌群Alpha多样性分析：Alpha多样性分析中的observed species指数、chao指数和ACE指数可反映样品中物种的丰富度(species richness)，即指数越大，说明样品中的物种越丰富。结果显示，手术21 d后，老年SNI模型鼠observed species指数、chao指数和ACE指数均较建模前显著降低，提示SNI模型菌群多样性降低。见图6。

注：*P<0.05

3 讨论

我国是老龄化社会，65岁及以上人口占人口总数的13.5%。关注老年人健康不仅是社会问题，同时也是重要的医学课题。老年人的焦虑症常常容易被忽略，可能会导致或加剧认知障碍或其他病症的发病，因此需要更多的社会关注和科学研究。前期大量的研究也发现，老年动物或者老年人会更容易出现焦虑行为，但是具体的分子机制还不清楚。老年焦虑症病人与青年焦虑症病人的发病机制是否不一样？这些都是有待研究的科学问题。本研究通过建立老年鼠慢性痛焦虑模型，分析对比肠道菌群的变化，探讨肠道菌群在老年鼠慢性痛焦虑模型中的作用，为进一步开展微生物治疗提供理论依据。

本研究所使用的是慢性痛焦虑模型小鼠，遭受慢性神经病理痛的病人会经历焦虑症或抑郁症的折磨，既往研究已经验证了此模型在感觉和情感情绪等维度的运用[7, 11]。本研究利用OFT和EPM检测出该模型老年小鼠具有焦虑样行为。

既往大量的研究结果显示,肠道菌群在抑郁症的发生中起关键作用[5]。但是，观察神经病理性疼痛模型的肠道菌群变化研究比较少。Yang等[12]发现神经病理性痛伴随兴趣缺失模型小鼠的肠道菌群发生了显著的变化。本研究中，肠道菌群分析结果表明，老年慢性痛焦虑模型鼠的肠道菌群结构发生紊乱，菌群多样性降低。在门分类水平，老年SNI模型小鼠2β-变形菌显著减少。在目分类水平，乳杆菌显著减少；在科分类水平，普雷沃氏菌显著减少。

既往研究认为，焦虑等不良情绪通过应激反应改变肠道通透性、破坏肠道黏膜屏障、激活免疫反应，从而导致肠道菌群紊乱[13]。反过来，肠道菌群也能通过多种途径在焦虑、抑郁等精神疾病中发挥着作用。近年来的“肠道菌群-肠-脑轴”(microbe-gut-brain axis, MGBA)学说被广泛认可。肠道菌群可以产生多种神经递质和神经活性分子，也可以通过发酵碳水化合物来增强免疫反应。目前已知的肠道菌群参与调控的神经递质包括了多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺等[14]。这些都可能是肠道菌群参与焦虑情绪发生发展的潜在机制。

目前，已经有研究着眼于通过肠道菌群的改变来治疗焦虑症。有研究发现，直接将肠道微生物移植到动物体内，就能导致目标动物发生行为学上的变化[15]。这也为进一步使用益生菌或进行粪菌移植提供了理论依据。Zheng等[16]将抑郁症病人的粪便移植到了无菌小鼠体内，发现小鼠发生了相应的菌群紊乱，并表现出抑郁样的行为。而在小鼠焦虑模型中，经过益生菌的治疗，小鼠行为可恢复正常[17]。动物实验表明，长双歧杆菌治疗的小鼠表现出较少的焦虑样行为[18]。益生菌和抗生素调节肠道菌群这一新靶点，可能成为治疗焦虑症的一个新途径。

综上所述，本研究通过建立老年鼠慢性痛焦虑模型，发现老年慢性痛焦虑模型小鼠的肠道菌群结构发生了紊乱，菌群多样性降低。在不同分类水平，菌群分布均发生了显著变化，这为开发新的治疗模式提供了理论依据。未来有待进一步开展高质量的研究，以期为证实肠道菌群与老年焦虑症病人的相关性及病因机制提供科学依据。