脂肪干细胞外泌体应用于瘢痕治疗的研究进展

谭景铭，周胤朴综述，张璟琳，汪 虹审校

0 引 言

瘢痕狭义上是指病理性瘢痕，是组织损伤非再生愈合的结果，是组织损伤修复的一种重要并发症[1]。病理性瘢痕表现为感觉异常、瘤样增生或伴有不同程度功能障碍，会影响患者身心健康[2]。一直是医学亟待解决的难题。

近年来的研究发现脂肪干细胞外泌体(exosomes derived from adipose-derived stem cell，ADSC-exos)通过在创面愈合的炎症、细胞组织增殖和重塑中发挥作用，从而影响瘢痕的形成，且ADSC-exos在所有间充质干细胞外泌体中拥有可稳定分泌[3]、安全性更高、易获得和保存[3]、副作用少、拥有较少伦理关系等优点[5]。本文总结国内外关于ADSC-exos治疗瘢痕的研究成果，阐述ADSC-exos应用于瘢痕治疗的潜在机制，为治疗创面瘢痕形成提供新的思路。

1 调控炎症

在生物学功能方面，ADSC-exos中的蛋白能使白细胞活化。炎性反应一方面作为抗感染的免疫屏障，另一方面刺激纤维组织形成以闭合创面。因此，适度的炎性反应有利于创面愈合。但是，当大量炎性细胞及其产生的促炎因子增加时，不仅加重炎性反应，延长炎症持续时间，还可导致细胞外基质过度沉积及组织纤维化[6]，进而形成病理性瘢痕。ADSC-exos从以下方面干预伤口的炎性反应。

1.1促进巨噬细胞(mø)极化为M2型mø参与机体的固有免疫，并调控炎症[7]。mø有两种表型M1和M2，M1在伤口中主要发挥促炎效果，M2在伤口中有抑制炎症并帮助修复伤口组织的功能，且在一定条件下可互相转化[8]。因此，mø从M1向M2的转化，有助于中断伤口修复过程中异常的炎症持续以及加速延迟的异常组织修复。

现有研究已表明，ADSC-exos能显著性下调mø中M1表面标志TNF-α 和IL-6的表达[9]，同时上调M2表面标志Arg-1和IL-10的表达[10]。证实脂肪干细胞(ADSC)主要是通过其外泌体发挥旁分泌功能调控M1向M2转化，但是具体的调控方式仍有待于进一步研究[11]。

赵汇等[12]认为经ADMSC-Exo刺激的mø是通过p-Stat3的表达上调，Stat3通路活化的方式使M2增加。不仅如此，还发现了ADSC-exos甚至可抵抗炎性因子(LPS、IFN-γ)对于mø极化为M1的作用，并使mø极化为M2。Hao等[13]认为ADSC-exos通过抑制M1极化的转录因子C/EBP-δ来抑制M1并刺激M2形成。有研究表明炎性因子对于ADSC-exos的控制其实非常精细，且恰恰正是炎症因子激活了ADSC-exos对于M1向M2的极化作用。研究使用炎性因子(IFNγ/TNFα)刺激过的ADSC-exos，使得已分化为M1的mø上调M2的标记CD163、CD206表达(即M1向M2极化)[14-16]。值得注意的是，被炎症细胞因子刺激过的ADSC分泌的外泌体包含与M2极化有关的miRNA(miRNA-34和miRNA-146)，而这些miRNA于未经炎性因子刺激的ADSC-exos中低水平表达。有趣的是，在最高浓度的炎性因子下，外泌体内与M1极化有关的miRNA(miR-127和miR-155)也在增加，但是相比于M2极化有关的miRNA数量上少得多。同时在最终验证蛋白功能中分析了 M2极化有关的miRNA(miR-34a，miR-146和miR-21 )靶向蛋白 (Notch1，IRAK1和Sirp-β1)的表达[17]。证明了ADSC-exos从miRNA产生到最后效应细胞的蛋白表达这个完整过程中的免疫抑制和抗炎潜能。表明ADSC-exos免疫调节特性可能不是本身ADSC-exos所固有，而是由伤口的炎症环境诱导并产生的[18]。

1.2降低炎性因子生成在关于小鼠特异性皮炎的研究中，用LPS刺激鼠巨噬细胞24h，引起了炎性因子一氧化氮(NO)的产生。但是，ADSC-exos以剂量依赖的方式显著降低了NO的产生。检查ADSC-exos对血清IgE水平的影响。结果表明，静脉内或皮下注射ADSC-exos，血清IgE水平以剂量依赖性方式显着降低[19]。降低了血清IgE水平ADSC-exos减少了嗜酸性粒细胞数量，但对嗜中性粒细胞的数量几乎没有影响。而后通过定量实时PCR(qRT-PCR)分析炎性细胞因子的 mRNA 水平。静脉注射给予ADSC-exos，剂量依赖性地降低了皮肤病变中IL-4，IL-31，IL-23和TNF-α的mRNA 水平。实际上，所有这些促炎细胞因子都是目前正在开发或最近被批准抑制炎症的生物制剂的靶标[20]。总体而言，这些数据表明，ADSC-exos可抑制炎症反应和炎症细胞因子的表达[21]。同样，在特异性皮炎的研究中，还报道了ADSC-exos可显著降低炎性因子如IL-5、IL-13、IFN-γ、IL-17[22]。其他的研究表明在ADSC-exos的作用下伤口中IL-6、CD14、CD19、CD68等细胞因子和趋化因子下调减轻了由多种刺激引起的炎症反应[23]。在裸鼠背部创面愈合的研究中，应用了ADSC-exos的创面组织中TNF-α和IL-6表达量在5周内逐渐降低，炎症反应程度减弱，在2至3周时显著增加抗炎因子IL-10的产生，在2周后显著增加抗炎因子IL-13的产生[24]。

1.3减少肥大细胞浸润肥大细胞会在伤口处脱颗粒[25]，在创伤修复过程中增加，并且肥大细胞在伤口修复过程的每个阶段都起作用，包括炎症、增殖和肉芽组织形成以及重塑阶段。在近来的很多研究中观察到病理性瘢痕相较于正常伤口处肥大细胞数量更多、活化更充分、脱颗粒作用也更强[26]。而关于特异性皮炎的研究中都证明了ADSC-exos可显著降低IgE介导的肥大细胞增加，有助于消减炎症作用[21-22]。

2 调整伤口的细胞外基质

伤口愈合的增生和重塑阶段与细胞外基质(extracellular matrix,ECM )的产生和重组密切相关，所以ECM的正常与否决定了瘢痕的存在以及瘢痕的严重程度。 胶原纤维在病理性瘢痕和正常伤口修复的比较中，组织和结构都出现了异常。疤痕组织的特征是ECM成分过度沉积，皮肤附件(如毛囊、汗腺)的缺失。在人体皮肤中，ECM含有纤维蛋白和基质。纤维蛋白包括胶原蛋白，弹性蛋白和纤连蛋白，并提供三维支架，在其上支撑或锚定单个细胞和血管网络[27]。其中，胶原蛋白是ECM最丰富的成分。所以ECM中胶原蛋白的情况也决定了瘢痕的情况[28]。人体皮肤中最丰富的纤维蛋白是胶原蛋白Ⅰ，胶原蛋白Ⅲ和胶原蛋白Ⅴ仅占总胶原蛋白的较小比例[29]。在无疤痕愈合的胎儿伤口与成人病理性瘢痕的比较分析则发现，无疤痕的胎儿伤口聚集了更多的Ⅲ型胶原蛋白[30-32]。而且伤口中的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)比组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)也高很多。

近来的研究表明ADSC-exos可增加伤口内Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原的比例。经过进一步分析，可能的机制是通过上调创伤皮肤组织中的Colla1的表达，下调Co13a1的表达。据报道，肌成纤维细胞嵌入其分泌的ECM中，并且还分泌MMP和TIMP以重塑该ECM。MMPs，特别是MMP1和MMP3在伤口愈合、瘢痕化过程中的重要作用已得到肯定。引起瘢痕形成的原因可能是TIMP-1增多而对MMP的抑制作用有关[33]。进一步研究表明了ADSC-exos在体外激活了皮肤真皮中成纤维细胞的ERK / MAPK途径，并通过激活ERK途径提高了MMP3的水平，从而增加了MMP3与TIMP1的比例并调节ECM的重塑以减少瘢痕[30]。应用ADSC-exos的创面中HE染色结果显示，第5周时伤口胶原排列相对整齐。在Masson染色结果中，胶原排列规整，胶原纤维含量相对稀疏。创面组织匀浆中的Ⅰ型胶原mRNA的表达量在4至5周增加，Ⅲ型胶原mRNA的表达量在3到5周增加，而更重要的是伤口逐渐趋于正常皮肤组织胶原的比率[24]。在Zhou等[23]的研究中采用了脂肪干细胞外泌体局部涂抹的方式治疗小鼠瘢痕，3次/d局部涂ADSC-exos治疗伤口时观察到了更窄的疤痕，且研究结果表明，ADSC-exos在晚期增加了胶原蛋白Ⅲ与胶原蛋白Ⅰ的比例，以抑制疤痕组织形成。最后在研究 ADSC-exos对皮肤创面屏障功能恢复的影响过程中，发现了ADSC-exos增加了一些皮肤屏障蛋白(如聚丝蛋白、Loricrin和AQP3)的表达水平，表明ADSC-exos有利于促进皮肤弹性和屏障完整性。有小鼠体内研究表明，在伤口愈合的早期阶段，ADSC-exos促进了胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的生成。最终结果显示，ADSC-exos在早期通过缩短愈合时间来促进伤口愈合，而在晚期，可能会抑制胶原蛋白的合成以减少疤痕的形成。这种趋势遵循组织伤口自然愈合期间观察到的组织学变化[34]。也就是说，在愈合的早期阶段胶原蛋白沉积更为重要，而在愈合的后期基质重建更为关键。

3 抑制成纤维细胞

成纤维细胞作为一种被炎症因子刺激，修复组织的细胞，在正常的伤口中可见到聚集，但成纤维细胞异常增生和过度活化会导致病理性瘢痕的形成[35-37]。在伤口正常愈合时，增殖阶段常表现为成纤维细胞被激活，并伴随一定数量的肌成纤维细胞形成[38]。但病理性瘢痕中肌成纤维细胞的数量往往较多[23]。α-SMA是肌成纤维细胞的已知标志物，赋予其高收缩力，进而形成疤痕。许多研究也报道了，TGF-β1和TGF-β3是参与ECM沉积和瘢痕形成的重要因素。TGF-β3曾被用作预防和减少疤痕的治疗药，并且是肌成纤维细胞的抑制剂，而TGF-β1则促进了肌成纤维细胞的分化和肉芽组织的形成。

近来关于张力性创面的研究中，由于受到张力的作用，可诱导成纤维细胞α-SMA的表达，然而 ADSC-exos能以剂量依赖的方式降低α-SMA的表达。在创面愈合不同时期，施加ADSC-exos的创面由于创周向创面中央的迁移增快，每个成纤维细胞所受到的表面张力随之相应的减小。ADSC-exos可能能够抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞细胞的转化，从而抑制瘢痕的过度形成[39]。其他的研究已表明ADSC-exos可抑制成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，并抑制肉芽组织的形成。ADSC-exos的处理使得α-SMA的表达显着降低，同时也降低了TGF-β1与TGF-β3的比率。且ADSC-exos抑制了成纤维细胞的分化并减少了伤口床中肌成纤维细胞的数量。总体而言，这些结果表明，ADSC-exos阻止了成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，并抑制了肉芽组织的形成[28]。近来有研究结果显示,ADSC-exos还能抑制人增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblast,HSF)的增殖，促进细胞凋亡。miR-34a过表达的ADSC-exos能有效抑制HSF的增殖，促进细胞凋亡，并且通过下调 TGF-β /Smad、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达抑制 HSF的纤维化和胶原合成来减少瘢痕的生成[40]。这些结果启示我们ADSC-exos在促进创面愈合和减少疤痕中具有积极作用。同时，若在伤口的早期愈合过程中采取干预措施，加速创面的愈合，并防止肌成纤维细胞过度增殖积聚，而不是在疤痕形成后采取补救措施，可能是治疗瘢痕的方法之一。

4 结语与展望

ADSC-exos作为一种易获得，排异反应低的物质，已在创面修复的研究中取得了大量成果，虽然已有大量研究表明ADSC-exos有助于瘢痕的治疗，但是大部分处于动物实验和基础实验的研究阶段，临床治疗还缺乏相应的依据。而且国内大多数文献仅报道了ADSC-exos修复伤口的前期作用，如能使细胞大量增殖和迁移，但却忽略了ADSC-exos后期对于伤口的影响，因为其实很多关于伤口修复的细胞和因子其实是把双刃剑，例如早期内皮细胞和成纤维细胞的增殖、迁移和炎性因子释放有助于伤口的快速修复，但是在伤口修复的后期过度的血管、细胞外基质生成和持续的异常炎症却导致了病理性瘢痕的形成。总之，ADSC-exos的研究为治疗病理性瘢痕提供了一个新的视角和思路。