肝癌类器官的培养及应用研究进展

廖晏蔺，刘正芸综述，王 欢审校

0 引 言

我国肝细胞癌的发病率位居世界前列[1]，其预后差，致死率高[2-3]，治疗上以包括手术切除、化疗在内的综合治疗为主[4]。大多数肝癌患者对药物治疗并不敏感[5]，对肝癌新药的研发迫在眉睫。肝癌研究模型可分为体内模型和体外模型两种。虽然体内模型是最大限度吻合机体组织结构相互作用的模型，但其存在一定的缺陷限制了它的应用；肝癌研究的体外模型主要是二维培养细胞系模型，但2D结构在许多方面都与原始肿瘤有很大的差异。因此，研究出能够稳定增殖且与机体微环境更加接近的原代肝癌细胞体外繁殖的创新方法是我们孜孜以求的目标[6]，类器官的出现给这一设想带来了新希望。

3D培养最早于1968年提出，类器官是3D细胞培养的一种产物，指的是由干细胞发育而来类似器官的一种三维培养物[7]。类器官培养基需要添加很多的生长因子，作用是维持干细胞的功能，驱动其扩增和分化[8]。类器官可来源于多能干细胞(human pluripotent stem cells, hPSCs)和成体干细胞(somatic stem cells)。其中多能干细胞可来源于胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs) 和诱导多能干细胞 (induced pluripotentstem cells，iPSCs)，成体干细胞则一般从临床患者的组织样本中分离得到[9]。近年来，胰腺肿瘤[10]，乳腺癌[11]，胃癌[12]等肿瘤类器官的成功构建，无疑给肿瘤研究带来了无限的可能，肝癌类器官在2017年首次被报道[13]，本文主要就肝癌类器官的培养方式及其相关应用研究作一综述，以期为肝癌研究提供更好的体外模型。

1 肝癌类器官的培养

1.1 组织来源的类器官组织来源的肝癌类器官的培养是指将临床肝癌病人术中取得的肿瘤组织运输回实验室进行体外3D培养，是肝癌类器官培养最常用的方法。其基本步骤是先将组织机械分离成小块，然后在37 ℃条件下用胶原酶或中性蛋白酶将其消化成单个或少许聚集细胞，消化时间和外源细胞污染会直接影响肿瘤细胞的产率，消化的时间与酶的种类、浓度、消化方式和作用时间等相关。有报道称用分散酶和0.1% DNase I 37 ℃ 摇床消化0.5 h～2 h即可[14]，而也有文献用Collagenase D(2.5 mg/mL)消化时间长达120 min-整夜[15]，消化完成后用基底膜提取物(BME)或Matrigel包裹分离得到的细胞，并按需接种于孔板内，加入含有特定众多生长因子的培养基便可诱导其分化为多种细胞类型组成的肝癌类器官，一般2～3 d换1次液。与传统二维培养的细胞相似，其也可进行传代，冻存，复苏等操作[8]。2017年Broutier等[13]在培养肝癌类器官的时候，发现正常肝脏组织衍生的类器官很快就超过了肝癌组织衍生的类器官，他们在经典的肝脏类器官培养方案的基础上，去除Noggin和Wnt3a、Respondin-1，添加地塞米松和Rho激酶抑制剂，同时增加了组织样本的消化时间，首次成功培养出肝细胞癌类器官、胆管细胞癌类器官和混合细胞癌类器官。培养出来的类器官重现了起源肿瘤的组织学特征，且在长期扩增过程中都如此。这无疑是肝癌体外模型的一个重大突破。2018年Nuciforo等[16]采用在超声引导下所获得的针刺活检组织成功培养出了肝细胞癌类器官，且将类器官注射入免疫缺陷小鼠体内可诱导小鼠肝癌，2019年Cao等[17]成功地从129个肝组织/肿瘤中培养出91个细胞系，这些类器官可以在体外长期生长，移植入4～6周龄雌性NOG/JicTa小鼠体内的类器官约20%形成了肝肿瘤，虽然类器官的来源相同，但在体内的增殖能力却有明显差异，值得一提的是，在长达32周的长期培养中肝癌类器官都保持了其原始肿瘤的基因组特征和遗传异质性[16]，证实了类器官模型的稳定性和吻合度。Liu等[18]成功地从小鼠原发性肝肿瘤中建立了能在体外长期生长的类器官，可见组织来源的类器官并不只限于人体组织，这使得其构建更方便快捷，更具可行性。2020年Driehuis等[15]详述了如何从各类上皮组织培养得到肿瘤类器官的步骤，并指出其建立的成功与否很大程度取决于所取到的组织标本的新鲜度和上皮组织的量。组织来源的肝癌类器官相比于2D培养模型在其应用和前景上都显示出高度的优越性。而在培养肝癌类器官时有一个特别的现象，低分化肝癌来源的类器官有着近乎100%的成功率，但高分化肝癌则无一例培养成功[9]。Nuciforo等[16]表明患者的临床相关特征与其肝细胞癌类器官成功与否之间无相关性，但类器官构建的成败与肝细胞癌的组织病理学分级有很强的相关性：所有的肝细胞癌类器官都来自低分化肿瘤。提示原发组织的干性与培养的成功率密不可分，因为肿瘤具有高度异质性，即使同一种恶性肿瘤也是由不同类型的肿瘤细胞组成，同一肿瘤组织的不同部位细胞分化能力也是不同的。故研究者们在培养肝癌类器官时，会从同一个组织不同位置取样培养。

1.2细胞来源的类器官通过重编程技术将细胞诱导至多能干细胞状态后进而分化为各种细胞类型是肝癌类器官培养的另一方式。诱导性多能干细胞分化能力与胚胎干细胞相似，可从皮肤成纤维细胞,单核白细胞、尿液中得到[19]，Sun等[20]将SV40LT转染进成纤维细胞后再使得P53，Rb失活，在细胞增殖能力变强的基础上转染三因子：FOXA3,HNF1A,HNF4A后成功培养出3D肝类器官。然后将c-myc转染进肝类器官后诱导60d便培养出了肝癌类器官，其培养出的细胞表现出明显紧凑性，显示高有丝分裂活性，核质比明显增加，与肿瘤表现出高度相似性。目前，诱导性多能干细胞起源的肝癌类器官还有待进一步探索，但其确可代表一个可通过基因水平的调控来模拟肝癌发生和发展的三维模型[21]。

肝癌细胞系是建立类器官的另一途径，但其目前相关研究较少，有研究表明将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞这三种细胞按照一定比例混合后，可在体外培养出可扩增的3D肝癌类器官模型。该模型构建方便快捷，可稳定增殖，或可成为应用最广的研究肝癌发生发展机制的模型[22]。

2 肝癌类器官的应用

2.1 疾病模型肝癌类器官是一种新型的3D体外研究模型，可在体外模拟重现肝癌疾病，有研究指出患者源性类器官对化疗和放疗的体外反应以及胰腺癌患者的实际临床反应具有强相关性，虽然肝癌类器官尚未有类似的报道，但其或可成为一种联系体内和体外的良好疾病模型[23]。利用患者源性肝癌类器官建立足够大的生物库，将患者的肿瘤特征与生物库的类器官匹配，从而让患者接受不同的治疗，也是一个非常有前景的应用方法[23]。还有研究将细胞来源的肝脏类器官用来研究宿主与肝炎病毒的相互作用[24]，这为攻破病毒性肝病打下了良好的基础。此外，肝癌类器官模型还可用于转化医学研究，并且具有和多种技术相结合的应用前景[9]。肝癌类器官模型有望成为以后长期研究肝癌发生发展，治疗的稳定模型。

2.2药物筛选临床用药的筛选模型现应用较广的有2D培养和人源组织异种移植物。但两者皆有不足，2D培养无法在体外长期维持肝细胞的细胞极性，传代后容易失去肿瘤的遗传异质性从而偏离原发肿瘤的特性。无疑增加了药物真正应用于人体上的失败率。而人源组织异种移植物模型周期长，成功率低，成本高。肿瘤异质性也是现今开发肿瘤药物的难点之一，肿瘤异质性不仅存在于不同个体之间，也同样存在于单个肿瘤内[25]。大规模测序研究指示肝癌基因组的异质性出乎意料[26]。从不同肝癌患者组织样本培养得到类器官后，用于一系列药物的测试筛选，或许是未来个体化治疗新方向[15]。

新兴模型类器官的出现为临床药物筛选提供了新设想，类器官模型展现出培养周期短，有着用于药物的高通量筛选和基因修饰[27]等优势。2019年Li等[28]利用人源肝癌类器官建立了27个肝癌株，筛查了129种抗肿瘤药物，发现临床一线胆管癌治疗药物如索拉菲尼，吉西他滨等在患者间表现出疗效异质性，并指出未用于肝癌治疗的药物如普卡霉素，伊达比星等可能有利于治疗，这无疑为临床治疗提供了新的选择。索拉菲尼和瑞戈非尼是临床治疗肝癌常用的靶向药物，2019年Cao等[17]利用类器官模型来测试两者的药物疗效，发现异体移植肿瘤和原发肿瘤类器官之间的反应性存在明显差异。次年Wang等[14]利用肝癌组织建立的类器官模型揭示了索拉菲尼可能的耐药机制，揭示了利用类器官模型进行未来耐药研究的可能性。

2.3个性化医疗个性化医疗又称精准医疗，是指针对不同患者量身定做最佳治疗方法。由于肿瘤的异质性，个体差异一直都是临床药物治疗十分棘手的问题之一，即使在具有相同基因型的患者中，药物反应也是不同的[29]。相比于传统体外二维培养模型，肝癌类器官在长达32周的传代培养中都保持了其原始肿瘤的基因组特征和遗传异质性[16]。现建立肝癌类器官的主要方式是取临床患者的肿瘤样本进行分离，诱导，扩增，可将体外培养的类器官进行基因型分析，制定适合该模型的治疗手段。建立患者衍生的类器官生物数据库用于个体化筛药治疗也是非常有前景的未来临床治疗方法，数据库可基于筛选结果在治疗上做到针对性和特异性。

3 难点和不足

肝癌类器官是一种具有广泛前景的体外研究模型，但其培养的成功率与原始肿瘤的分化程度和肿瘤细胞的增殖率密不可分[16]，肝细胞肝癌增值率较低，类器官成功率也较低[30]。这增大了其培养的难度。据现有文献报道，来源于分化程度高的患者的肝癌类器官的培养暂无成功的例子。其次，十余种昂贵的生长因子的添加使得研究人员在配制新鲜的培养基时要注意将其调整至合适的浓度，生长因子的具体作用机制及其相关联系也尚未完全阐明。肝癌类器官缺乏血管、免疫细胞等多种细胞类型，并不能完全重现复杂的肿瘤微环境[31]，当在体外长期培养时，类器官中心的细胞由于缺乏氧供和营养会出现大量凋亡的现象，研究者应密切关注类器官状态和培养时间及时进行传代。

4 结语与展望

肿瘤类器官主要是利用患者的肿瘤组织进行体外3D培养用来模拟体内肿瘤组织的生物学特征。相比于常用的2D培养模型，肝癌类器官模型可最大限度地模拟亲代肿瘤的基因组及组织学结构和肿瘤发生机制。肝癌类器官模型之所以能在短时间内成为人们关注的焦点，与其针对患者个体化药物治疗的新希望密切相关，其有望打破异质性这一难题，走向肝癌发生发展研究的新进程。然而，肝癌类器官模型仍存在很大挑战，基质胶支撑的时间有限，长期培养需不断传代，培养价格昂贵，构建成功率较低，无确定的权威培养方法等。但相信未来随着肝癌类器官培养模型的不断完善，将成为最普及，高效的研究肝癌发生发展的体外模型。