INSL3在女性生殖调节中的作用研究进展

陈甜，陈卓，杨婧

(1.贵州医科大学，贵阳 550004； 2.贵州省人民医院妇产科，贵阳 550004)

胰岛素样肽(insulin-like peptides，INSL)3、INSL4等肽激素的共同点在于其可作为分泌肽被合成，这类肽结构包括3个肽域，即N端的B域、中间的C域和C端的A域，其中B域和A域非常保守，两者可形成相同且相对刚性的三维骨架[1]。有证据表明，松弛素和INSL的C域大部分被切除，且无论C域是否存在，松弛素和INSL肽均保留了完整的生物活性[2-3]，主要原因为C域在肽与物种之间的差异较大，在结构上相对灵活，不会与受体结合。除松弛素H1、松弛素H2外，还有部分INSL家族成员(如INSL3、INSL4)也与生殖生理学相关，包括睾丸下降、哺乳、妊娠和分娩等[3]。人绒毛膜促性腺激素、催产素以及INSL也被称为“新激素”，主要通过促性腺激素和类固醇等系统调节内部受精和妊娠相关生理功能[4]。INSL3最初在猪和小鼠中作为一种独特的睾丸特异性基因转录物序列被发现[5]。目前哺乳动物INSL3的主要合成位点在睾丸间质细胞[6]。INSL3通常被认为是一种雄性特异性激素，但也在雌性哺乳动物窦卵泡的类固醇膜内细胞及黄体中表达[7]。现就INSL3在女性生殖调节中的作用予以综述。

1 INSL3信号通路及生理功能

1.1INSL3受体 INSL3在结构上与松弛素密切相关，其同源受体为G蛋白偶联受体7，亦称为松弛素家族肽受体(relaxation family peptide receptor，RXFP)2。编码RXFP2的基因包含18个外显子，除表达为全长功能的受体外，还可表达为多种长度的剪接变体，但这些剪接变体的生物学功能目前尚未明确[8]。RXFP2的主要特点是1个大的胞外域，其中N端包含1个低密度脂蛋白-A模块，然后是10个富含亮氨酸的重复序列，最后是1个富含半胱氨酸的铰链区连接第一个跨膜域[1]。研究表明，INSL3主要通过激素B链内的残基与RXFP2富含亮氨酸的重复序列表面的氨基酸相互作用，且这种作用具有较高的特异性与亲和力，因此包含B结构域的INSL3二聚体分子只能作为RXFP2受体拮抗剂，因为INSL3二聚体与RXFP2相互作用不会导致RXFP2激活[9]。体内的INSL3与RXFP2结合可导致胞外域向下弯曲，从而启动低密度脂蛋白-A、INSL3的A链与7跨膜区结合，调控下游信号通路[10-11]。虽然高水平松弛素H2也可在体外激活RXFP2，但在体内松弛素生理水平几乎不可能激活RXFP2，因此在体内INSL3与RXFP2相互作用的特异性较高[10]。过表达RXFP2后，INSL3启动的主要第二信使为兴奋性G蛋白，而兴奋性G蛋白激活可导致腺苷酸环化酶产生环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，进而激活β联蛋白并刺激磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B信号通路，进一步激活Wnt和Notch通路的下游信号[10，12]。

研究显示，RXFP2基因在牛卵巢内膜细胞和卵母细胞以及黄体中均有表达，但在颗粒细胞或卵丘细胞中未见明显表达；通过刺激牛窦状卵泡中的cAMP表达可调控INSL3，在牛黄体细胞中也可通过增加孕酮水平达到类似的效果[13]。另有研究表明，大鼠卵母细胞中的RXFP2可能以连锁方式参与卵母细胞的成熟过程[14]。在牛子宫内膜以及人子宫肌层中均发现RXFP2基因表达，但在人子宫肌层细胞中并未发现cAMP对INSL3的调控作用[13]。RXFP2与RXFP1在人肌瘤组织中均有表达，且大鼠平滑肌瘤ELT-3细胞中的INSL3表达可导致转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)诱导的Smad2磷酸化作用减弱，表明INSL3可能具有抗纤维化作用[15]。RXFP2基因也表达于大鼠子宫肌层和子宫内膜，当子宫血流受限时其表达增加[16]。此外，RXFP2转录本在早期植入前胚胎中的表达也显著增加[16]。

1.2INSL3-RXFP2通路的生理学功能 RXFP2仅在大鼠窦前卵泡的卵母细胞中表达，而INSL3可通过诱导卵母细胞产生生长分化因子9、刺激膜雄激素受体的产生等作用于窦前卵泡，从而诱导卵泡生长[17]。在牛窦状卵泡中，即使不存在黄体生成素(luteinizing hormone，LH)水平显著升高，也会表达RXFP2受体，而RXFP2不仅可调控INSL3的表达，还会导致cAMP表达增加[18]。研究表明，INSL3-RXFP2通路对窦卵泡功能的调节具有较大影响，低剂量(约0.1 ng/ml)的LH在体内可导致卵泡内膜细胞INSL3表达上调，高剂量(>1 ng/ml)LH可导致INSL3表达下调，而内膜细胞分泌的INSL3表达水平的变化可诱导17α-羟化酶表达，17α-羟化酶则负责孕烯醇酮或孕酮中卵泡类固醇前体雄烯二酮的产生[19]。用INSL3或其受体RXFP2的干扰小RNA处理内膜细胞，可导致依赖17α-羟化酶的雄烯二酮的产生途径被完全抑制，同时雄烯二酮被生长中的窦卵泡的颗粒细胞吸收，雄烯二酮可作为卵泡刺激素活化的芳香酶产生雌激素(雌酮、雌二醇)的主要前体，而雌二醇可通过雌激素受体α或雌激素受体β上调内膜细胞INSL3的表达；卵泡内膜细胞中雌激素的作用模式可能并不是经典模式，因为在INSL3基因启动子附近并未发现雌激素反应元件，而雌二醇可能通过类固醇生成因子1成为对INSL3发挥作用的关键因素；在INSL3-RXFP2通路中，雄烯二酮可优先通过雌激素受体α或雌激素受体β刺激INSL3合成，而真正的雄激素(如二氢睾酮)则无刺激INSL3合成的作用[18]。用阿比特龙处理卵泡发现，雄烯二酮本身可刺激分离的卵泡内膜细胞产生INSL3，主要由于阿比特龙可特异性下调17α-羟化酶的表达，进而导致INSL3表达下调[20]。

此外，骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)4、BMP5和BMP6等也可显著抑制牛卵泡内膜细胞INSL3-RXFP2通路的表达，BMP可由卵母细胞和(或)颗粒细胞产生，通过丝氨酸/苏氨酸激酶受体发挥作用[21]。研究发现，炎症因子[如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)]和表皮生长因子在体外均可抑制牛卵泡内膜细胞中的INSL3-RXFP2通路；此外，胰岛素和(或)胰岛素样生长因子1可促进牛卵泡内膜细胞中的INSL3合成[22]。目前的研究表明，INSL3与RXFP2作为自分泌/旁分泌系统共同发挥作用，在月经周期开始时协调和放大低水平LH、雄烯二酮和雌激素的作用，从而促进和协调月经周期的进行；上调卵泡BMP水平有助于抑制月经后期INSL3-RXFP2通路的表达，从而直接抑制INSL3的表达；高剂量人绒毛膜促性腺激素可影响猕猴卵泡液INSL3水平，表明INSL3可能在卵泡内起作用，直接调控卵母细胞的成熟[23]，但这些研究结果未来还需更多研究验证。

2 INSL3在女性体内的表达

2.1循环系统中的INSL3 免疫测定法显示，健康成年男性循环系统中的INSL3水平通常为0.5～2.0 ng/ml，而高灵敏度荧光免疫分析法显示，女性循环系统中INSL3的检出限为10 pg/ml；在女性的婴儿期和幼儿期，INSL3无法检测到，只有青春期才可检测到INSL3，在健康的育龄期女性中，最高的INSL3表达水平仅约为200 pg/ml；在整个月经周期INSL3以阶段性方式产生，并可代表窦卵泡生长的单个波，而女性月经周期中这种卵泡波具有可变性，某些女性卵泡期有2个波，另一些女性的卵泡期只有1个波[24]。由于女性卵泡波存在个体差异，整个月经周期中的INSL3平均水平并不具有代表意义。随着更年期正常月经周期的停止，在循环系统中无法检测到INSL3表达，因此绝经后女性的血清通常被作为INSL3免疫测定的阴性对照，表明卵巢可能是女性循环系统中INSL3的唯一来源[25]。

循环系统中的INSL3表达变化可反映健康年轻女性的卵泡内膜细胞功能。一项针对约1 000例不孕女性的横断面研究显示，诊断为多囊卵巢综合征的患者循环系统中的INSL3水平显著升高，而通过窦卵泡计数和抗米勒管激素水平判定的卵巢储备功能低下患者的INSL3水平显著降低，且INSL3水平与窦卵泡计数呈显著正相关[26]。有研究者通过测量不同大小牛窦卵泡内膜组织中的INSL3信使RNA水平发现，直至排卵前阶段，其表达水平均稳定增加[27]。

2.2卵巢中的INSL3 原位RNA杂交实验和免疫组织化学检测法在奶牛、人类和狨猴的卵巢中均发现 INSL3表达，但在颗粒细胞、卵丘细胞或卵母细胞中却未检测到INSL3表达[28]。用两种不同的INSL3抗体对牛卵巢进行免疫组织化学研究发现，在健康生长的窦卵泡中INSL3的表达水平最高，且INSL3缺失可能是卵泡闭锁最早的标志物之一，甚至早于任何类固醇生成酶缺失[17，28]。此外，黄体中也存在INSL3信使RNA，在牛黄体期早期INSL3信使RNA表达较低，但随着黄体的生长INSL3信使RNA的表达逐渐增加，而随着黄体的溶解INSL3信使RNA的表达逐渐降低；在狨猴妊娠期间，其黄体中的INSL3表达较稳定，妊娠牛黄体中的INSL3信使RNA表达与狨猴妊娠期类似；在小鼠卵巢中，单个视野内的黄体INSL3染色不均匀，表明INSL3表达可能是一个动态模式，而这种动态表达是否有助于将INSL3分泌至循环系统目前尚不清楚[7]。

INSL3不仅可分泌至血液，还可积聚在窦卵泡液中。检测猕猴和奶牛的卵泡液发现，与血液相比，卵泡液中的INSL3水平显著升高，猕猴卵泡液中的INSL3浓度约为1 ng/ml，而牛卵泡液中的INSL3浓度高达400 ng/ml[18]。在猕猴体内注射人绒毛膜促性腺激素诱导排卵可导致窦卵泡中的INSL3水平降低，但在牛体内注射人绒毛膜促性腺激素并未发现INSL3水平与卵泡大小或类固醇水平的关系。

2.3妊娠期及胎儿体内的INSL3 有研究者通过比较受孕第17天的绵羊与非受孕绵羊的血清发现，INSL3可能成为妊娠早期的生物标志物；此外，怀有雌性胚胎的奶牛和猪妊娠中期血液中的INSL3水平与发情期的INSL3水平相似[29]。此外，在人子宫内膜上皮和胎盘中也检测到低强度的INSL3免疫组织化学染色，特别是合体滋养层细胞[30]。在妊娠期间，男性胎儿也可产生INSL3，在妊娠早期至中期的过渡期间胎儿睾丸间质细胞可产生大量INSL3，且INSL3与胎儿睾丸下降的第一个经腹阶段有关，其可激活胎儿韧带上的RXFP2[31]。因此，羊水中的INSL3水平可作为睾丸发育良好的生物标志物[31-32]。在母牛体内，雄性胚胎内的INSL3可穿过胎膜和胎盘，因此在母牛外周血清中可检测到INSL3表达，表明INSL3作为一种性别特异性激素，可影响胎盘和母牛的生理或病理状态，且与类固醇不同，INSL3由男性胎儿特异性的产生，而女性胎儿在整个妊娠期间均未出现INSL3合成[31]。

3 小 结

在卵巢窦卵泡内，INSL3-RXFP2通路可通过刺激17α-羟化酶的表达促进雄烯二酮的产生。作为一种生物标志物，INSL3亦可在监测健康窦卵泡的生长方面发挥关键作用。INSL3是一种由卵巢产生的激素，在青春期至更年期循环系统中的INSL3水平为100～200 pg/ml，在此区间INSL3可很好地刺激远端组织中的RXFP2。因此，INSL3或其同源受体激动剂均可作为更年期激素替代的新策略。此外，INSL3还可参与多囊卵巢综合征的发生发展，但具体机制尚未明确。目前关于INSL3在女性生殖调节中的作用研究仍处于初级阶段，未来还应深入研究INSL3在女性生殖调节中的作用，为以INSL3为靶点的女性生殖疾病药物的研发提供帮助。