综 述 线粒体相关内质网膜参与调控脑缺血再灌注损伤的研究进展

钱 军， 王艳云， 叶群英综述， 罗红波审校

缺血性脑卒中是临床上比较多见的脑血管疾病，根据流行病学调查研究的数据显示，2019年我国缺血性脑卒中发病率为1700/10万[1]，占全部脑血管疾病的85%以上，针对缺血性脑卒中，应力争尽早对缺血的脑组织实施再灌注治疗，挽救缺血半暗带是临床上首要治疗原则，但血流和氧气的恢复会加重大脑损伤，甚至造成不可逆的损害，这种现象被称为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)[2]，CIRI的机制复杂，主要有线粒体能量代谢障碍、钙离子超载、氧化应激、细胞凋亡、炎症反应、兴奋性氨基酸毒性、血脑屏障破坏、NO合成过多、细胞焦亡等[3]，线粒体相关内质网膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane，MAM)是线粒体与内质网(ER)紧密连接但未融合的动态结构，许多研究发现MAM在许多细胞过程中发挥重要作用，如调控Ca2+稳态、线粒体动力学、氧化应激、炎症反应、脂质代谢、细胞凋亡、自噬等[4]，近年研究发现，MAM参与的细胞事件和脑缺血再灌注后发生大脑损伤的病理生理机制高度重合，因此，了解MAM参与调控脑缺血再灌注损伤的病理生理机制可能成为治疗和预防CIRI提供新的方向。本文结合国内外文献就MAM参与调控脑缺血再灌注损伤的研究进展作一综述。

1 MAM的概述

内质网和线粒体之间膜接触的概念最早出现在脂质研究中，Ruby[5]等人用电子显微镜观察到线粒体与内质网之间有开放的通道，并发现有蛋白质从内质网转移到线粒体。到目前为止，MAM的存在已经通过不同的技术得到证实，包括活体成像、新的电子显微镜方法和亚细胞分离等。线粒体相关内质网膜的最佳定义是与线粒体接触的内质网膜，但两者接触部位紧密相连却不融合。在真核细胞中，线粒体与内质网的相互作用主要由内质网-线粒体接触复合物(ER and mitochondria encounter structure,ERMES)介导，但在哺乳动物细胞中，线粒体与内质网界面更具有复杂性，两者之间的联系不是静态的，而是随细胞状态的不同而动态改变，两者之间接触部位的间距在10～30 nm之间波动[6]，接触总面积在5%～20%之间波动，这种联系方式使得线粒体与内质网在有联系的同时又保持各自的特性。有研究表明，在脑缺血再灌注中，线粒体有丝分裂的上调会提供神经保护[7]，Sun[8]等发现通过抑制内质网应激可以减轻脑缺血再灌注损伤，对神经有保护作用，可见MAM在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用。

线粒体与内质网的动态连接涉及多种蛋白的参与，如电压依赖性阴离子通道(VDACs)、线粒体融合蛋白1/2(Mfn1/2)、1，4，5-三磷酸肌醇受体(IP3R)、酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51(PTPIP51)、囊泡相关膜蛋白相关蛋白B(VAPB)、葡萄糖调节蛋白75(GRP75)、PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)等[9]。

2 MAM参与调控CIRI的病理进程

2.1 钙离子稳态 钙离子稳态是细胞中大部分生化反应的基础，钙离子主要在内质网储存，在线粒体中发挥作用，调节细胞基本功能。钙离子从内质网转移到线粒体高度依赖MAM，尤其是MAM所募集的IP3R/Grp75/VDAC构成的Ca2+通道[10]，其中IP3R定位于内质网膜，是ER释放Ca2+的主要通道之一，电压依赖性阴离子通道蛋白1 (VDAC1)是位于线粒体外膜(OMM)上的Ca2+通道,葡萄糖调节蛋白75(GRP75)可以将IP3R的配体结构域与VDAC1连接，因此GRP75是连接两个细胞器两侧两个蛋白的关键分子[10]，VDAC1和IP3R通过与GRP75相互作用，维持内质网与线粒体之间的钙离子稳态，这是维持线粒体正常功能所必须的。此外，MAM中还存在其他促进ER和线粒体之间Ca2+有效转移的蛋白质复合物，如VAPB-PTPIP51复合物[9]。研究发现，线粒体与内质网之间紧密接触的距离可能会影响线粒体功能，当两者之间的距离<5 nm(通过电子断层扫描显示)会促进线粒体的钙超载导致细胞损伤[11]，这种距离是随着IP3诱导胞浆中Ca2+的增加而动态变化。综上所述，MAM通过感应细胞质中钙离子浓度，可能会动态改变形状，进而改变组织间距离，以进行合适的细胞反应或信号转导。另一方面，当线粒体内大量Ca2+长期存在时，会引起线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的开放，脑缺血再灌注后，MPTP开放会引起线粒体破裂，最终导致细胞死亡，Huang[12]等研究发现羟基红花黄色素A通过线粒体通透性转换孔抑制细胞凋亡减轻脑缺血再灌注损伤。在脑缺血再灌注损伤病理进程中，Ca2+超载和细胞凋亡是组织损伤的重要机制，在脑缺血再灌注后，可通过调控MAM募集的蛋白构成的通路减少Ca2+内流，避免Ca2+超载引起的细胞死亡，减轻脑缺血再灌注损伤。

2.2 线粒体动力学 线粒体动力学主要包括线粒体融合、分裂、自噬等。线粒体融合主要通过融合蛋白介导，如融合蛋白1/2(mfn1/2)和Optic atrophy 1(Opa1)，mfn1/2定位于线粒体外膜，Opa1定位线粒体内膜，分别介导线粒体内外膜的融合[13]，其中的mfn1只定位于线粒体，而mfn2不仅定位于线粒体，而且在MAM中大量存在，当线粒体融合增强时，ATP合成增加以及细胞的氧化磷酸化水平上升，能量合成增加，另外，线粒体融合还参与线粒体的合成与受损线粒体的修复。线粒体分裂主要由分裂蛋白调控，如动力蛋白相关蛋白1(DRP1)、裂变蛋白1(FIS1)及线粒体分裂因子(MFF)，其中DRP1主要定位于细胞质，当线粒体分裂时，DRP1被分裂因子募集到线粒体膜上与FIS1结合，DRP1与FIS1的复合体使GTP酶构象发生变化，GTP水解释放能量，进一步诱导线粒体分裂[14]，DRP1的活性可以被多种蛋白所调控，其中有一种突触融合蛋白Syntaxin17，据报道该蛋白定位于MAM和线粒体，并确定DRP1在MAM中的定位和活性[15]。线粒体自噬主要是由自噬蛋白，如Bnip3、Nix等所调控，及时消除功能失调的线粒体并保留适当的线粒体数量对于正常的细胞功能和细胞生存是不可或缺的，线粒体自噬被认为是线粒体质量和数量控制的核心机制[16]，自噬的发生首先需要形成自噬体，大量研究表明，自噬体在MAM处形成[17]，同时，线粒体的融合与分裂状态可维持线粒体自噬的发生。张逸[18]等在对脑缺血再灌注损伤模型大鼠进行研究时，通过检测大脑缺血组织中的线粒体相关动力蛋白的表达发现，脑缺血再灌注的急性期损伤(1 d)会显著增加线粒体融合、分裂蛋白OPA1、Drp1的表达，而在脑缺血再灌注长期损伤(7 d)的缺血脑组织中线粒体融合、分裂蛋白OPA1、Drp1的表达水平显著下降，研究发现，通过干预脑缺血再灌注的急性期损伤和长期损伤中OPA1、Drp1的表达水平，可以减轻脑缺血再灌注损伤，陈运转[19]等在大鼠脑缺血再灌注损伤模型中发现，抑制细胞自噬可引起神经元损伤加重,自噬的发生可能对神经细胞发挥保护作用。上述数据表明，MAM在线粒体的融合、分裂、自噬等方面发挥重要作用，同时，线粒体动力学也是脑缺血再灌注损伤的重要机制，通过干预脑缺血再灌注后的线粒体相关动力蛋白的表达以及线粒体自噬可减轻脑缺血再灌注损伤。

2.3 氧化应激 氧化应激是指机体内的氧化与抗氧化的状态失衡，体内自由基超过正常范围而导致的组织细胞氧化损伤反应，其中线粒体是自由基产生的主要场所[20]。在MAM上有多个氧化调节剂，其中最常见的是胞质衔接蛋白p66Shc，MAM处可见p66Shc浓度增加，p66Shc是一种介导线粒体活性氧(ROS)生成的氧化还原酶[21]，当发生氧化应激时，MAM蛋白p66Shc被激活，转位到线粒体，参与了ROS的形成。此外，MAM驻留蛋白Ero1-Lα的水平升高可能会增加ROS的产生和内质网中钙离子的释放[22]。另一方面，MAM蛋白p66Shc可以参与导致细胞凋亡的信号通路，因为p66Shc中含有一个额外的N-末端富含脯氨酸的胶原结构域(CC2)，其中含有一个丝氨酸磷酸化位点(Ser36)，该位点对促凋亡非常重要[23]。上述数据说明MAM在氧化应激和细胞凋亡中发挥重要作用，同时氧化应激和细胞凋亡也是造成脑缺血再灌注损伤的重要机制。

2.4 炎症反应 NLRP3炎症小体是目前为止唯一被报道与MAM有关的炎症小体，同时NLRP3也是介导细胞经典焦亡通路的关键分子[3]，可被细胞器内的活性氧(ROS)正调控，此外，当线粒体的活性失调时，NLRP3激活受到抑制。在NLRP3未受刺激时，大部分定位于细胞质和内质网，NLRP 3作为固有免疫重要的模式识别受体参与了缺血后的炎症损伤，NLRP 3炎症小体不仅能识别外源性病原体，也能够感知自身内源性危险信号(如缺血再灌注损伤)，是炎症级联反应的关键分子通路，当发生缺血再灌注损伤时，NLRP3被激活，激活NLRP3进一步激活凋亡相关斑点样蛋白(ASC)并与ASC重新定位于MAM，激活的ASC进一步招募pro-caspase-1并将其激活，被激活的caspase-1可以诱导包膜穿孔、死亡，使胞内物质释放引起炎症反应，同时促进促炎因子IL-1β、 IL-18成熟分泌[24]，Fann[25]等研究发现脑缺血缺氧后 NLRP3、ASC 及caspase-1等蛋白表达增加，阻断caspase-1后可减轻脑缺血后的神经损伤。另一方面，MAM还参与神经酰胺的产生[26]，神经酰胺是一种生物活性鞘磷脂，对调节细胞生长停滞、分化、凋亡和炎症非常重要。以上数据都说明了MAM在炎症反应中发挥重要作用，同时，炎症反应也是脑缺血再灌注损伤的重要机制之一。

3 MAM可能作为脑缺血再灌注损伤潜在的治疗靶点

MAM所参与的细胞事件与脑缺血再灌注后发生的病理生理机制高度相关。可以通过抑制MAM上募集的IP3R/Grp75/VDAC钙离子通路和VAPB-PTPIP51复合物，从而减少缺血再灌注时的钙离子超载，减轻缺血再灌注损伤，已经有研究发现，通过敲除PTPIP51，可以减少由VAPB-PTPIP51复合物介导的钙超载，可以大大减轻缺血再灌注后细胞的损伤[27]。如前文所述，MAM所募集的线粒体融合蛋白(mfn)以及定位于MAM上的调控DRP1活性的突触融合蛋白在线粒体的分裂以及融合中发挥重要作用，可以通过调控MAM上的线粒体融合蛋白(mfn)以及分裂蛋白的调节蛋白等蛋白的表达，进而干预细胞内线粒体的分裂和融合，控制细胞内线粒体的质量和数量，在满足能量需求的同时，清除损伤的线粒体，减少因线粒体功能障碍引起的缺血再灌注损伤，研究发现，通过上调存在于MAM上的mfn2可促进线粒体生物合成从而抑制细胞凋亡[28]，盐酸戊乙奎醚可通过线粒体动力学机制对心肌缺血再灌注损伤有较好的保护作用[29]。可以干预MAM蛋白p66Shc的激活和Ero1-Lα的水平，减轻氧化应激对缺血再灌注的损伤，P66Shc的缺失已被证明可以减轻缺血再灌注损伤，然而，p66Shc诱导的ROS的形成也参与了胰岛素信号的传递，可能参与了抵抗轻度缺血再灌注损伤的内源性防御[30]。还可通过阻断与MAM相关的NLRP 3炎症小体的激活，减轻炎症反应对缺血再灌注的损伤。

综上所述，MAM可通过多个方面参与脑缺血再灌注损伤的病理进程，调控MAM募集的蛋白的表达，能够减轻细胞缺血、缺氧引起的氧化应激，保证线粒体的数量和质量，还可干预MAM参与的炎症反应，均可以减轻缺血再灌注损伤，这为MAM作为脑缺血再灌注损伤治疗的潜在靶点提供依据。

4 展 望

线粒体和内质网是细胞中发挥多种功能的细胞器，而MAM作为线粒体与内质网(ER)紧密连接但未融合的动态结构，影响细胞的生命周期，MAM通过调控Ca2+稳态、线粒体动力学、氧化应激、炎症反应、脂质代谢、细胞凋亡、自噬等多种途径，决定着细胞的命运。从脑缺血再灌注损伤的机制上分析，MAM的功能与其高度重合。如前文所述，近年来已有研究发现，通过干预MAM所募集的蛋白，可以减轻缺血再灌注损伤，如敲除PTPIP51、上调mfn2的表达等，这都说明MAM可能是治疗脑缺血再灌注损伤的靶点。要确定MAM与脑缺血再灌注损伤是否有关系，首先需要明确在发生脑缺血再灌注损伤中患者的MAM是否有异常，如MAM募集的蛋白的表达、线粒体与内质网之间接触面积的变化等，但由于MAM的组成和功能的复杂性和多样性，也为量化MAM的水平变化带来挑战。目前，MAM仍然有许多有待研究的问题，MAM的研究对探究脑缺血再灌注损伤等疾病的治疗靶点具有重要意义。