重症肌无力相关基因和表观遗传学的研究进展

林晶晶， 李培军， 陶林霜综述， 胡蓓蕾审校

重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是一种由自身免疫抗体介导的疾病，作用于神经肌肉接头(neuromuscular Junction,NMJ)，其主要临床特点是肌无力和易疲劳。MG以眼外肌的受累最为常见，随疾病的进展，常从一组肌群开始逐渐累及其他肌群。MG发病率相对较低，全球患病率约为10～20/10万人[1]。但MG患者有突发重症肌无力危象的可能，会导致呼吸肌无力，引发呼吸衰竭甚至危及生命。MG疾病具有明显的异质性，在自身抗体方面，乙酰胆碱受体(AChR)、肌肉特异性激酶(MuSK)和低密度脂蛋白受体相关蛋白4 (LRP4)的自身抗体已被证实具有致病性[2]。现有的研究发现MG的易感性和疾病的严重程度与免疫系统的调节异常可能相关[3]，另有研究发现MG的发病受遗传和环境等多种因素的综合影响，其中遗传因素是MG易感性的重要原因之一。随着检测手段的发展，表观遗传学在MG中的作用也逐渐被发现和重视，包括非基因序列的改变引起基因表达变化和DNA甲基化以及非编码微小RNA(microribonucleic acids,miRNAs)等。

1 重症肌无力的相关基因

目前的遗传学研究认为，人类白细胞抗原(HLA)基因、淋巴细胞相关蛋白4基因(CTLA4)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体22型基因(PTPN22)及自身抗原基因(CHRNA1)等与MG相关[4～7]。

1.1 人类白细胞抗原基因(HLA) HLA定位于人体细胞第6染色体短臂上，具有高度多态性，包括3个亚型。近50年前就有研究发现HLA基因组中含有大量与人类免疫系统相关的基因，HLA被认为是与MG易感性密切相关的因素。有研究通过收集北美地区的病例，发现HLA-DQA1与MG相关，且MG的早发型和迟发型存在重叠的疾病相关基因位点[4]。另一项研究对北欧地区的病例，发现HLA-B*08是主要的相关等位基因，早发型MG中相关的MHC与经典的I类等位基因HLA-B*08有关，提示HLA-B*08为MHC中的主要风险等位基因，且在女性中HLA-B*08与早发型MG的相关性比男性更强[6]。最近的一项Meta分析发现LA-DRB1*16∶02等位基因与MG相关。且研究发现该位点与主要由自身抗体介导的疾病相关，与T细胞介导的无关[8]。这些研究表明，HLA等位基因多态性与MG临床亚型之间的关系是复杂的，不同性别、种族、地区以及疾病类型等，HLA基因频率是存在差异的。

1.2 细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4基因(CTLA4) CTLA4基因具有多态性，CTLA4蛋白是由活化的T细胞表达的45-kD免疫球蛋白，与CD28具有明显的一致性序列。CTLA4增加T细胞运动性，减少T细胞和抗原呈递细胞之间的接触时间，导致细胞因子产生减少。通过这种方式，CTLA4被认为可以下调T细胞活化，终止T细胞反应，并防止自身免疫[9]。Drachman等人发现位于CTLA4上游3.3kb的Rs231770处观察到强关联信号，通过实验用CTLA4-Ig治疗MG大鼠模型，证明了其有效性[4]。另外，有研究者通过分析基因型和等位基因频率，发现MG组的Rs733618*C等位基因频率明显高于对照组。Rs733618位于启动子区域，其可促进转录因子的特异性结合，从而影响CTLA4的剪接和基因表达[10]。以上发现的SNPs可能与自身免疫性疾病有关，而MG是T细胞依赖性疾病，这进一步说明了CTLA4与MG的密切相关性。近期有研究者通过收集已发表AchR阳性患者的GWAS数据分析与MG相关的基因，发现了2个CTLA4附近的遗传变异随后的分析发现这些变异导致了CTLA4的低表达[11]。CTLA4基因多态性与重症肌无力临床亚型及重症肌无力患者糖皮质激素敏感性是否存在一定的相关性是未来研究的方向。

1.3 蛋白酪氨酸磷酸酶非受体22型基因(PTPN22) PTPN22基因位于1号染色体短臂(1p 13.3-1p13.1)上，编码淋巴特异性酪氨酸磷酸酶，可抑制T细胞信号传导。全基因组关联分析(GWAS)证实了PTPN22与MG相关，已发现PTPN22的变体与MG有关[6,12]。在许多抗体介导的自身免疫性疾病中，PTPN22基因是最强的非MHC遗传风险因子，研究者通过Meta分析发现PTPN22 R620W多态性与早发型MG患者发生相关[13]。而近期另一项转录组关联研究(TWAS)中提出PTPN22基因在晚发型MG患者中与疾病的相关性比早发型MG患者更显著[14]。由于基因存在多态性，仍需要进一步研究，但可以看出PTPN22基因与疾病密切相关。

1.4 肿瘤坏死因子受体超家族成员11A(TNFRSF11A) TNFRSF11A编码抗原呈递树突状细胞表面表达的核因子-κB的4.5kDa受体激活剂，该受体是T细胞和树突细胞之间相互作用的重要调节因子，对免疫监视和调节特异性免疫都至关重要。研究发现TNFRSF11A与MG相关[9]，而且TNFRS11A相关信号在晚发型MG中明显增强，但不存在于年轻MG患者。因此推测与年龄相关的局部基因表达变化容易导致对自身抗原的异常免疫反应。近期Ruth等人的GWAS分析和全转录组关联研究(TWAS)同样表明TNFRSF11A位点在迟发型MG患者中比早发型MG患者中与疾病的相关性更明显[14]。这些发现表明，除MHC基因外，遗传因素在老年重症肌无力的发病中起着重要作用。在缺乏其他证据的情况下，TNFRSF11A是否与年龄、特定的种族和其他MG亚型相关，还需要进一步研究。

1.5 自身抗原基因(CHRNA1)及自身免疫调节因子(AIRE)基因 CHRNA1是编码AChRα亚基的基因，位于2号染色体长臂。CHRNA1中的启动子变体编码的AChR亚基，被发现与MG有关。AIRE基因的变异与自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎和慢性甲状旁腺功能减退症有关。研究发现CHRNA1中的Rs16862847和Rs2229957、AIRE中的Rs3761389和CTLA4中的Rs733618均与MG显著相关，CHRNA1的SNP中的关联性最高。而且CHRNA1的Rs16862847的G等位基因载体是预测高水平AChR抗体的独立危险因素。遗传相互作用分析揭示了CHRNA1、AIRE和CTLA4对MG易感性起协同作用[5]。 近期关于MG的GWAS和TWAS的研究中发现CHRNA1位点在迟发型MG患者中比早发型MG患者与疾病的相关性更显著[14]。CHRNA1编码突变被认为是导致先天型重症肌无力的原因之一，其特征是突触后膜上功能型乙酰胆碱受体数量显著减少。基于对MG的研究，我们认为上述研究中发现的基因信号导致疾病发生可能存在以下几种机制。例如，胸腺或其他免疫细胞中CHRNA1表达的改变可能会干扰对乙酰胆碱受体免疫耐受的发生发展或导致胸腺内免疫产生。

1.6 重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)相互作用蛋白1(TNIP1)基因 也称为A20结合抑制NF-κB激活因子(ABIN1)，位于染色体5q32-33.1上，具有共同的泛素结合结构域以及与TNFAIP3和其他NF-κB家族成员相互作用的共有结构域。与TNFAIP3一样，TNIP1具有抑制活性，其过表达可降低TNF、IL-1和LPS诱导的NF-κB1活化[15]。TNIP1中第151位(Pro→Ala)的编码变异体(Rs2233290)呈现了较强的风险关联。151Pro在物种间高度保守，PolyPhen-2和其他根据蛋白质结构稳定性的算法都预测Ala的替代是有害的。TNIP1在早发型MG中的关联暗示了涉及蛋白依赖的NF-κB信号传导失调的疾病机制[6]。近期有研究者通过 GWAS数据分析同样发现TNIP1与EOMG相关[11]，TNIP1是TLR信号通路的关键调控因子[16]。TLR信号的靶向治疗可能为EOMG疾病的治疗提供新的途径，这值得进一步研究。

2 表观遗传学在MG中的应用

随着检测手段的发展，表观遗传学在疾病中的作用也逐渐被发现和重视，包括非基因序列的改变引起基因表达变化(如DNA甲基化等)、以及非编码微小RNA(miRNAs)等。

2.1 DNA甲基化 在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。是DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。与遗传修饰不同，表观遗传变化的可逆性使它们成为治疗靶点。例如，去甲基化药物可以沉默不应该表达的基因，从而通过药物调节甲基化来达到治疗的效果[17]。胸腺瘤与多种自身免疫性疾病相关，其中约30%～40%的胸腺瘤与MG有关[18]，关于MG患者的胸腺瘤发生的表观遗传变化知之甚少。研究证实通过DNA启动子甲基化可使肿瘤抑制基因沉默，例如脆性组氨酸三联体(FHIT)、错配修复蛋白Mut L同源物1(MLH1)和E-钙黏蛋白(E-cad)。有研究分析了接受胸腺肿瘤切除术MG患者的血液、肿瘤组织和正常胸腺上皮细胞中，与一碳代谢(MTHFR)和DNA甲基化(DNMT1、DNMT3A和DNMT3B)相关基因的DNA甲基化水平。发现MTHFR和DNMT3A启动子在胸腺肿瘤组织中相对于血液显示出更高的甲基化，并且MTHFR在胸腺肿瘤组织中也显示出与相邻正常胸腺上皮细胞相比更高的甲基化水平[19]。

前面已经提及CTLA4和MG之间存在相关性。DNA甲基化可以调节CTLA4的表达，从而对调节Treg细胞功能具有重要意义。有研究通过测量外周血中的CTLA4甲基化水平，而发现MG组CTLA4甲基化的水平明显高于对照组，且CTLA4甲基化也与MG患者的胸腺状态有关。该研究还发现干扰甲基化会导致AChR-Ab表达抑制，E-AChE的活性降低以及淋巴细胞中的Treg细胞比例降低。说明CTLA4甲基化可以通过上调AChR-Ab和E-AChE促进MG的发生，增加相关细胞因子的表达[20]。

2.2 微小RNA(miRNA) miRNA是一组进化上保守的、长度约为22个核苷酸的非编码RNA，通过沉默靶基因调节转录后的基因表达[21]。miRNA可以被释放到细胞外并在血清和血浆等体液中而易于被测量到，寻找到与MG相关的特异性miRNA可提供新的诊断途径和可能用于疾病监测，同时识别miRNA及其靶基因可提供MG发病机制有价值的信息并可能开辟新的治疗途径。

Huang等人通过RT-PCR技术检测MG组和对照组外周血单个核细胞中miRNA表达情况，结果显示miRNA-21和miRNA-126的表达存在差异[22]。Bo等通过数据分析发现hsa-miR-145-5p表达存在差异[23]，这与Wang等人在EAMG模型上发现下调的miR-145促进致病性T17细胞反应一致[24]，说明miRNAs可能在MG发病机制中发挥重要作用。另有研究发现miR-7-5p是MG患者胸腺中下调最多的miRNA之一。miR-7对趋化因子配体21(CCL21)蛋白表达产生影响，miR-7-5p表达的降低可能是导致CCL21在MG胸腺中过表达的原因。Cron等人还观察到miR-125a-5p在早发型MG患者的胸腺中过表达，在胸腺瘤相关MG中也上调[25]，这表明它可能参与调节胸腺瘤，而且miR-125a可能在MG患者中Treg细胞功能降低中起作用。在MG中，测量AChR或MuSK的血清自身抗体滴度不能完整的反映疾病进展。然而最近研究发现AchR型MG患者体液中的miR-150-5p和miR-21-5p的水平升高，且免疫抑制治疗后的MG患者和胸腺切除术后获得临床改善的MG患者体内的miR-150-5p水平则较低[26]。这说明在之后的研究中，类似miR-150-5p的miRNA可能被发现作为MG疾病改善监测的潜在生物学标志物。miRNA的发现对于改进MG检测也同样有着重要价值和意义。

3 小结与展望

重症肌无力在人口学特征、临床表现、诊断方法阳性率及治疗效果上都表现出明显的异质性，而MG亚型对治疗的反应都是不尽相同的。随着分子生物学技术的发展，现代医学正逐步迈进精准医疗时代，MG相关基因的发现及表观遗传学的应用，在未来对提高MG的诊断率及治疗提供指导。而且我们需要新的治疗方法，不仅需要应对严重和难治性MG，而且需要应对那些对现有治疗副作用大、不能耐受的患者。MG相关基因的发现及表观遗传学的应用，有望对MG的诊断和治疗提供新的数据和思路。