脑缺血再灌注痰瘀互结证动物模型的研究进展

白永军，张令霖，连新福

缺血性脑卒中是一种具有高发病率、高死亡率和高致残率特点的常见脑血管疾病，而痰瘀互结证是缺血性脑卒中的常见中医类型之一[1-2]。实验动物模型是疾病生理病理研究的重要载体，是医药卫生发展的不可或缺的支撑条件。早在1984年国际脑血管病委员会就曾提出，缺血性脑卒中的研究应以局部脑缺血动物模型为研究对象，并对该模型的制作方法提出了明确要求[3]。根据中医学病证结合的诊疗理念，制作成功的脑缺血再灌注痰瘀互结证动物模型对缺血性脑卒中的研究具有重要意义。本研究从实验动物的选择、造模方法的选择、线栓的选择、进线深度、再灌注时间、中医证型的建立等多个方面对脑缺血再灌注痰瘀互结证动物模型制作方法的研究现状进行综述。

1 实验动物的选择

目前，在人类疾病的基础实验研究中，大鼠、小鼠、犬、猴、家兔等为较常用的模型动物。但由于脑血管疾病研究的特殊性，实验动物的选择有所局限。猴虽具有和人类非常相近的高级神经中枢，但由于研究成本高昂，不利于开展大样本的重复性研究；家兔的大脑皮层、神经血管发育不完善，无法达到理想的研究效果；而犬的颈部动脉分支丰富，不易通过阻断单支血管形成稳定病灶[4]。相比之下，大鼠由于具有与人类相近的脑血管解剖结构，能较好地模拟现代医学上脑梗死的病理状态；价格较为低廉，容易获取，有利于大样本重复性实验的开展；大鼠的生理病理学研究较为成熟，可供参考的文献资料丰富；颈部血管清晰，变异性小，手术操作容易；脑缺血面积容易掌控，梗死体积较大且恒定；性情温顺，种系纯合型较好；繁殖、生长发育较快；血量较大，容易采集，可同时满足一项研究中的多个指标的检测需求等优点，近年来十分受研究者青睐[5-7]。

国外研究发现，由于受雌性激素对脑神经保护作用的影响，雌性大鼠脑缺血后的梗死面积明显小于雄性大鼠，因此，脑血管疾病的研究更多推荐选用雄性大鼠[8]。郭淑娟等[9]通过探究不同性别大鼠脑梗死体积及脑血流值的差异发现，在脑缺血再灌注损伤后雌性大鼠的脑梗死体积明显小于雄性大鼠，并推测这可能与雌性大鼠的低基础脑血流值有关。闫峰等[10]亦研究发现，雄性大鼠的脑血流基础值明显高于雌性大鼠，推测雌性大鼠脑梗死面积小、病死率低可能是由于其脑血流基础值水平相对较低导致对脑缺血再灌注的耐受性提高引起的。黄会芝等[11]通过探讨性别因素对新生大鼠的缺氧缺血性脑损伤脑发育的影响，结果发现新生雄性大鼠更容易受到缺氧缺血性脑损伤危害的影响，出现严重的脑损伤以及偏瘫症状。

另外，动物的周龄大小和体重也会对实验的成功率有一定的影响。当动物体重太小时，线栓不易插入，造模难度加大，甚至会损伤血管壁，导致出血意外；当体重太大时，可能会因为线栓无法很好栓塞血管，血流阻断不完全，达不到理想的缺血效果。Tang等[12-14]研究发现，当造模大鼠约为8周龄大小，体质量控制在250～300 g时，既能达到理想的造模效果，又能将手术对大鼠造成的伤害降到最低。甄毅岚等[15]研究也发现，动物体质量是影响脑缺血再灌注造模稳定性的重要因素，当雄性小鼠体重在25 g左右时，模型的死亡率相对较低，而成功率相对较高，是造模的理想选择。

2 脑缺血再灌注动物模型的建立

2.1 造模方法的选择 近年来创立发展的脑缺血再灌注动物模型的造模方法主要包括开颅电凝阻断法、开颅结扎法、光化学诱导法、线栓法、气囊栓塞法、颅外动脉注入微栓子等，其中线栓法最为常用[16-17]。采用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型是由Koizumi等[18]在1986年首次提出的；1989年Longa等[19]对该造模方法进行了改良，为模拟人类疾病理想模型提供了一个全新的实验方法。该方法具有不需要开颅、对动物损伤较小、操作简单、缺血部位易于掌握且恒定、能有效控制再灌注时间、闭塞效果较为理想的特点，因此，被国内外研究者一直沿用至今。

为提高造模的成功率，解决插线困难、死亡率高等问题，近年来，有一些研究者对Longa的插线法又进行了一系列的改进。目前，线栓的进入方式主要有从颈外动脉残端插入至颈内动脉颅内段和颈总或颈内动脉切口插入两种。两种进线方法各有优劣，经颈外动脉插入鱼线的方法通过游离颈总、颈外、颈内动脉，并从颈外动脉插入鱼线直至颅内，该方法的优点在于不需要结扎颈总动脉，能有效实现颈总动脉的再灌注，而缺点在于由于受颈内、颈外动脉之间形成的夹角的影响，导致造模手术的难度加大，甚至需要用显微镜辅助完成；相比之下，从颈总动脉进线操作难度低很多，但因该方法需要结扎颈总动脉，导致再灌注时主要借助对侧循环来实现，这与临床病人实际病理表现存在一定差异[20]。孙宇等[21]提出线栓从颈总近颈内外分叉处进入血管制备的大脑中动脉缺血再灌注模型梗死灶恒定、耗时少。徐秋英等[22]通过结扎右翼腭动脉、右颈外动脉后，在右颈外动脉距结扎处近心端处开一小口，将线栓经小口沿颈内动脉推进入颅以阻断大脑中动脉血流复制脑缺血再灌注模型。

研究发现，造模过程中如果结扎或离断翼腭动脉，在颈内动脉内的线栓周围则更容易形成血栓，引起血管闭塞，影响再灌注时的血液供给。吴远华等[23]主张在造模过程中不进行翼腭动脉的分离和结扎，这样一方面可以缩短手术时间、降低组织损伤；一方面可以减少血栓形成、降低感染风险，从而最大限度地确保造模成功率。刘波等[24]发现以往方法制作的脑缺血动物模型在再灌注时容易出现栓线回缩，染色剂染色后颜色不明显的现象，因此，其在线栓长度和染色操作上进行了改良，研究发现通过增加线栓长度可以明显降低线栓回缩到切口的发生率，同时再灌注耗时也显著缩短，另外采用棕色安瓿进行染色能提升染色的效果。

2.2 线栓选择及进线深度 理想的大样本脑缺血再灌注动物模型应该尽可能地具备梗死部位及面积一致、稳定性高、可重复的特点，否则将可能严重影响研究结果的可信程度[25-26]。脑缺血再灌注动物模型的质量及成功率受多种因素影响，其中选择合适的线栓至关重要。目前可供选择的线栓种类繁多，其中包括尼龙线栓、鱼线、聚乙烯醇线栓等。近年来许多学者研究发现，采用尼龙线制作的线栓造模对动物的影响最小，模型稳定好，并且具有很好的可重复性。尼龙线栓使用较多的是3-0和4-0两种规格的线，由于3-0尼龙线栓在操作时较4-0的线更容易导致蛛网膜下隙出血，因此4-0尼龙线更为常用。Koizumi等[18]曾提出通过在尼龙线前端包裹硅树脂的方式制作标准的线栓；而Longa等[19]则主张通过烧灼的方法使尼龙线前端变成光滑圆头，经加工后制作标准的栓塞线栓。

为进一步提升线栓的适用程度和造模成功率，有研究者对线栓的制备进行了改良。刘波等[24，27]在Longa EZ制作方法的基础上进行了改良，即将尼龙线前端烧灼成圆形之后，放入多聚赖氨酸溶液中包裹后使用。李洪亮等[28]采用固体石蜡包裹的方式制备线栓，结果发现该方法制作的线栓前端光滑圆钝、大小一致，在造模时不易损伤动脉血管，大大提高了造模的成功率和缺血再灌注效果。张文芳等[29]研究发现，对于体质量25～30 g的小鼠，采用头部直径为0.26 mm的线栓进行造模，成功率高，脑梗死面积大，且具有更好的可重复性。

另外，除了选择合适的线栓之外，进线深度也是困扰研究者多年的疑难问题，进线深度太过容易刺破颅内Willis环血管，从而造成蛛网膜下隙出血，产生不可逆影响[30]。张亚敏等[27]研究发现，对于体质量为(238±6) g的大鼠，线栓进线深度为18 mm便能达到大脑中动脉入口处，此时指端会有明显的阻力，不可强行用力，否则进线过深容易引起蛛网膜下隙出血，或者将大脑中动脉完全堵塞，出现大面积脑梗死。刘国军等[31]通过对比研究发现，线栓进线深度越大大鼠脑梗死体积也越大，而大鼠成活的概率却越小；当大鼠体质量在260～300 g时，进线深度控制在20 mm，能很好地保证造模成功率。在再灌注方面，Heydenreich等[32]建议在栓塞1.5 h后将线栓拔出，完成再灌注；刘娅迪等[33]则主张在2 h后拔出线栓，恢复脑血流24 h实现再灌注。

3 痰瘀互结证型的建立

成功的脑缺血再灌注痰瘀互结证动物模型对于研究脑梗死病人的生理病理特点以及临床诊治具有非常重要的意义。研究发现，脂质代谢紊乱和血液流变学的改变分别是“痰浊”“瘀血”的主要生物学机制之一[34]。脑动脉血管壁内皮损伤是动脉粥样硬化发生的始动因素，而动脉粥样硬化又是缺血性脑卒中发病的重要病理学基础之一。动脉血管内脂质沉积、血小板聚集导致血管壁狭窄，血行迟缓，均属于中医学上“痰浊”“瘀血”的表现。凌爽等[35]研究痰瘀互结证型模型大鼠的血流动力学改变及红细胞膜的生物学特征变化发现，通过喂养脂肪乳剂(由胆固醇、猪油、胆盐等组成)可导致胆固醇升高，引起血浆黏度增大，红细胞膜血清超氧化物歧化酶(SOD)酶活力降低。宋建民等[36]通过灌胃高脂食物(由猪油、胆固醇、甲基硫氧嘧啶组成)6个月后，插入微型双极电凝镊凝闭双侧椎动脉的方法复制痰瘀型脑缺血再灌注大鼠模型，并予以痰瘀同治的脑泰通颗粒治疗验证模型中医证型成功。

潘永明等[37]通过高脂饲料喂养大耳白黑眼(WHBE)兔结合手术造模的方法建立痰瘀互结证心肌缺血模型，并通过检测血脂代谢变化及血液流变学指标变化验证模型中医证型。李卫民等[38]采用高脂饮食(由猪油、胆固醇、甲硫氧嘧啶、吐温等组成)结合左侧颈总动脉结扎的方法复制缺血性脑卒中痰瘀互结证大鼠模型，并通过检测血脂、血栓素、纤溶酶原激活物抑制物(PAI)、血液流变学等指标的改变情况发现，该方法建立的模型符合脑卒中痰瘀互结证的临床特点。刘抒雯等[39]采用脂肪乳(由羊油、胆固醇等组成)灌胃复合线栓法制作痰瘀互结证大脑中动脉阻塞大鼠模型，并利用具有痰瘀同治作用的扎里奴思方进行反证，结果发现，与假手术组比较，模型组血液流变学(全血黏度、血浆黏度)和血脂水平[总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]均明显升高，其症状符合痰瘀互结证的病理表现；而扎里奴思方干预组大鼠的全血黏度、血浆黏度以及脂质代谢紊乱状态较模型组明显改善，此研究证实通过高脂高胆固醇饮食结合大脑中动脉栓塞的方法可以成功复制脑缺血再灌注模型。

本课题组亦曾采用高脂喂养复合大脑中动脉阻塞的方法制作脑缺血再灌注痰瘀互结证大鼠模型，通过4周高脂饲料喂养后，大鼠血脂出现明显紊乱，其症状表现符合动脉粥样硬化和痰瘀互结证中“痰”的特点，再通过大脑中动脉栓塞的方法造成局部大脑缺血缺氧，其症状表现符合痰瘀互结证中“瘀”的特点[5]。

在构建脑缺血再灌注痰瘀互结证动物模型方面，普遍主张采用高脂喂养结合一侧大脑中动脉栓塞的方式，该方法建立的模型会出现血脂代谢紊乱、血液流变学等生化指标的改变，符合缺血性脑卒中痰瘀互结证的特点。

4 小 结

经过30多年的发展，采用线栓法制作脑缺血再灌注动物模型的技术已趋于成熟，但关于病证结合动物模型的研究报道目前还很少。脑缺血再灌注痰瘀互结证动物模型同时具备了疾病西医病理改变和中医证候的特点，相比于单纯的疾病模型，其更能全面、客观、准确地反映中药或者中成药的作用机制。基于目前文献研究结果了解到，大脑中动脉阻塞是公认的制作脑缺血再灌注动物模型的理想方法；而在复合高脂喂养之后，可以成功建立病证结合脑缺血再灌注痰瘀互结证动物模型。由于该模型的造模时间长、手术要求高、复合影响因素多，将来仍需要更多大样本的实验研究对造模细节进行改进优化，以期为中医药治疗脑血管疾病的研究提供更为优质的动物模型。