IgG1类抗IgE Fc单克隆抗体抑制人肥大细胞脱颗粒作用研究

周翔鱼，曹羿堃，李 娜，储晨晨，华 冰，王 佳，张秋丽

变态反应是由IgE介导的I型速发型超敏反应，肥大细胞作为变态反应速发相应答的优先靶细胞， IgE 与其高亲和力受体 FcεRI结合，使机体处于致敏状态[1-2]。类胰蛋白酶(TPS)和组胺(HIS)的释放量可作为肥大细胞脱颗粒的标志物[3]。此外，介导I型超敏反应的效应细胞存在抑制性Fc受体-CD32b(FcγR2b)，由胞内免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIMs)介导发挥重要的免疫负向调节作用[4]。本研究以人LAD2肥大细胞为靶细胞，采用杂交瘤技术制备IgG1型大鼠抗人 IgE-Fc单克隆抗体(anti-IgE-Fc mAb)，探究一种新型抑制肥大细胞脱颗粒效应的体液免疫策略。

1 资料与方法

1.1 一般资料：2020年2月于宁夏医科大学实验动物中心购买10只8～10周SPF级雌性SD大鼠，体重(180±1.58)g，自由摄食饮水。

1.2 试剂：Y3 Ag1.2.3骨髓瘤细胞和人LAD2 肥大细胞，均购自深圳豪地华拓生物科技有限公司。人IgE Fc蛋白(hum-IgE Fc)由空军军医大学祝道成教授惠赠。

1.3 方法

1.3.1 抗IgE-Fc单克隆抗体制备：将100 μg hum-IgE Fc蛋白每间隔2周免疫SD大鼠，共致敏4次后取脾脏组织，制备脾细胞悬液与Y3 Ag1.2.3骨髓瘤细胞以5∶1混合，在50% PEG4000作用下，经HAT和HT培养基中筛选融合杂交瘤细胞。有限稀释法筛选杂交瘤细胞株，经hum-IgE Fc、OVA和β-内酰胺酶包被ELISA板鉴定anti-IgE-Fc mAb特异性。收集上清，ELISA试剂盒测定IgG1和IgM浓度。

1.3.2 LAD2细胞脱颗粒变化：实验分组为Compound 48/80组(Comp 48/80)、Comp 48/80+hum-IgE Fc、Comp 48/80+anti-IgE-Fc mAb和Comp 48/80+hum-IgE Fc+anti-IgE-Fc mAb，分别体外培养48 h，0.05 μm Comp 48/80刺激各组45 min，阴性对照(Control)不做任何处理。甲苯胺蓝染色观察各组LAD2细胞脱颗粒现象并收集上清液，ELISA试剂盒测定HIS和TPS浓度变化。

1.3.3 TPS和CD32b蛋白表达变化：采用Western blot法检测，即取各组细胞在裂解蛋白酶作用下提取总蛋白，通过BCA试剂盒对其浓度进行检测；上样电泳后220 V恒压转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入Rabbit-anti-TPS(1∶500)、Rabbit-anti-CD32b(1∶1 000)和mouse-β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；HRP标记二抗(1∶20 000)，室温孵育1 h，ECL化学发光液，曝光，Image J软件分析蛋白条带。

2 结果

2.1 anti-IgE-Fc mAb制备及亚类鉴定：经HAT培养液筛选后呈团状生长，细胞间杂交成功。采用有限稀释筛选出分泌anti-IgE-Fc mAb 的特异性杂交瘤株2F4和6D12；ELISA结果显示，与对照组比较，IgG1表达上调(P<0.05)，IgM差异无统计学意义(P>0.05)，即抗原特异性杂交瘤细胞分泌anti-IgE Fc单克隆抗体亚类为IgG1型。

2.2 LAD2 细胞脱颗粒实验：与对照组相比，各组LAD2 肥大细胞均释放大量酸性颗粒呈紫红色，脱颗粒程度增加，HIS和TPS释放浓度均显著增加(P<0.05)。与Comp 48/80组比较，Comp 48/80+hum-IgE Fc组和Comp 48/80+anti-IgE-Fc mAb组脱颗粒程度无明显变化，HIS和TPS释放差异无统计学意义(P>0.05)；而Comp 48/80+hum-IgE Fc+anti-IgE-Fc mAb组释放酸性颗粒减少，HIS和TPS释放浓度明显降低(P<0.05)，见表1，图1(封三)

2.3 LAD2细胞TPS和CD32b蛋白表达变化：Western blot 结果显示，与对照组相比，Comp 48/80组、Comp 48/80+hum-IgE-Fc和Comp 48/80+anti-IgE-Fc mAb组TPS蛋白表达均上调(P<0.05)，CD32b表达差异无统计学意义(P>0.05)。Comp 48/80+hum-IgE Fc+anti-IgE-Fc mAb组与Comp 48/80组、Comp 48/80+hum-IgE-Fc组相比TPS表达下调，CD32b表达明显上调(P<0.05)。结果提示，anti-IgE-Fc mAb在游离的IgE-Fc存在时可抑制人肥大细胞脱颗粒，这种作用可能是由CD32b介导。

3 讨论

临床治疗变态反应疾病的各种IgG型单克隆抗体受到越来越多的关注，其中的作用机制亟待阐明。本研究通过构建重组人IgE Fc蛋白制备动物源性单克隆IgG1类抗体，经过人源化转换并进行鉴定分离纯化，筛选2株特异性IgG1型抗IgE Fc单克隆抗体的稳定杂交瘤细胞株。体外实验结果显示，Compound 48/80为肥大细胞非特异性激活剂，诱导人肥大细胞剧烈的脱颗粒反应(P<0.05)。Compound 48/80和hum-IgE Fc共同刺激肥大细胞后，肥大细胞酸性颗粒含量变化较单独Compound 48/80作用不明显，培养液上清液中HIS和TPS释放浓度差异无统计学意义，且LAD2肥大细胞TPS及CD32b分子表达均无明显变化(P>0.05)。由于hum-IgE- Fc蛋白不存在抗体Fab段的抗原互补决定区，不能有效识别结合特异性抗原，Fc结合FcεRI后不发生受体变构和交联，无法启动信号级联反应诱导人肥大细胞活化脱颗粒[5-6]，与实验结果一致。采用Compound 48/80与anti-IgE-Fc mAb联合作用于LAD2肥大细胞，颗粒含量变化较单独Compound 48/80作用不明显，培养液上清中HIS和TPS释放浓度，TPS及CD32b分子表达无明显变化(P>0.05)。研究表明，IgG1类anti-IgE-Fc mAb的Fab抗原结合区可竞争性与人IgE- Fc段抗原结合，肥大细胞上是否存在已装配的IgE分子，由于IgG1类抗体的Fc段不能与FcεRI相互作用[7]。因此，单独刺激LAD2细胞时无脱颗粒效应。采用制备的anti-IgE-Fc mAb联合Compound 48/80和hum-IgE- Fc致敏LAD2肥大细胞，酸性颗粒释放却明显减少，上清液中HIS和TPS释放浓度降低，TPS蛋白下调，CD32b表达却增加(P<0.05)。有研究发现，肥大细胞表面表达CD64、CD32b等IgG1受体，IgG1-Fc与CD64结合时产生靶细胞活化效应，但无关肥大细胞脱颗粒信号途径的激活[8]。IgG1是CD32b的配体之一，能够诱导CD32b表达上调，IgG1-Fab可以特异性地识别游离的或已结合在肥大细胞上的IgE-Fc区，在IgG1-Fc区同时与CD32b结合，才可以启动胞内ITIMs，引起的肥大细胞脱颗粒反应以及胞内颗粒组装，进而减轻I型超敏反应的炎性反应[9-10]。可见，CD32b的免疫负调节作用有助于抑制I型超敏反应的病情进展。

本研究结果提示，以游离的IgE-Fc作为变应原诱导机体产生针对特异性抗原的IgG1型体液免疫，有望成为I型超敏反应的免疫治疗策略之一。但本研究中诸多机制有待于进一步阐明，如CD32b抑制性信号通路中的关键调节蛋白分子还没有明确，这种抑制肥大脱颗粒作用机制究竟发生于颗粒组装还是运输，或是膜融合及胞吐环节也尚待进一步研究证实。