百里醌类似物ATQTHB对肺癌细胞株A549增殖与凋亡的影响

马 刚，纳 莉，王 婷，黄 菱，李凯璇

肺癌是威胁人类健康的重大疾病，是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，预后差，5年生存率低于15%[1]。黑种草子是阿拉伯地区及我国新疆、云南、西藏等地的特色植物。现代研究表明，黑种草子具有止咳平喘、抗肿瘤、保肝、降脂等多方面药理功效[2-4]。百里醌是黑种草子的主要成分之一。文献报道百里醌对肺癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞有抑制增殖、促进凋亡的作用[5]。ATQTHB是由MUJAHID YUSUFI等学者[6]首先合成并报道的百里醌类似物之一，研究发现ATQTHB对胰腺癌细胞的增殖具有明显的抑制作用。ATQTHB对肺癌细胞是否也具有抑制增殖的作用，目前尚未见到文献报道。本研究以人肺腺癌A549细胞为主要研究对象，研究百里醌类似物ATQTHB对其增殖是否具有抑制作用，为抗肿瘤药物筛选提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：人肺腺癌细胞系A549和人正常肺上皮细胞系BEAS-2B均购自中国细胞资源库保藏中心。CCK-8试剂盒购买自北京索莱宝公司；流式凋亡检测试剂盒采购自北京达科为生物公司；小鼠抗人Bcl-2单克隆抗体、小鼠抗人BAX多克隆抗体购买自美国Abcam公司；内参Actin抗体、HRP-兔抗小鼠IgG抗体购自北京金杉中桥公司。RPMI 1640和胎牛血清(FBS)购自美国invitrogen公司。Percoll试剂和PBS缓冲液购自北京索莱宝公司。CCK-8检测采用全波长分光光度仪(美国Thermo公司)；流式检测采用美国贝克曼库尔特有限公司CytoFLEX流式细胞仪；Western blot实验电泳、转膜及曝光系统是美国Bio-rad公司设备。

1.2 实验设计：①委托药明康德公司人工合成百里醌类似物ATQTHB，纯度95%。②随后，采用CCK-8细胞增殖实验分析不同浓度的ATQTHB(18.75、37.5、75、150、200、300、400、600 μg/mL)对肺癌A549细胞增殖是否具有抑制作用以及最适干预浓度。③采用最适浓度干预，分为5组：空白对照组、A549细胞组、A549细胞+ATQTHB干预组、人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)组、BEAS-2B细胞+ATQTHB干预组。采用CCK-8法分析细胞增殖抑制情况，采用流式细胞术检测细胞凋亡水平，采用western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达水平。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 CCK-8检测细胞增殖：取对数生长期A549细胞或BEAS-2B细胞分别种入96孔板， 200 μl每孔含有 1×104个细胞， 培养24 h后分别加入200 μl终浓度为18.75、37.5、75、150、200、300、400、600 μg/mL的ATQTHB溶液，对照孔仅加入完全培养基。孵育48 h后吸去上液，加入50 μg/mL的CKK-8溶液100 μl，培养4 h后吸去上液，加入150 μl DMSO，脱色摇床振荡10 min后用酶标仪检测 570 nm/490 nm 密度值(OD值)。

1.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡：经上述各组处理后收集细胞，用PBS清洗2遍，4 ℃、400×g离心5 min。调整细胞浓度为1×106个/mL，采用流式凋亡试剂盒中FITC-Annexin V和PI的4 ℃避光孵育30 min后，PBS清洗2遍，4 ℃，400×g离心5 min。细胞重悬于300 μl PBS缓冲液，经100目滤网过滤后，用Beckman公司CytoFLEX流式细胞仪上样检测。使用LEGENDplex软件(美国Biolegend公司)分析数据。

1.3.3 Western blot分析：提取总蛋白后制备等量样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,并将蛋白质转至硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭2 h，洗膜后分别加入一抗：小鼠抗人Bcl-2抗体、小鼠抗人BAX抗体，4 ℃孵育过夜。取出平衡室温后加入兔抗小鼠 HRP-IgG二抗，室温孵育1 h，加入增强化学发光显色液，立即采用ChemiDoc XRS+化学发光成像系统进行曝光拍照。条带灰度扫描分析用Image J灰度分析软件，结果以目的蛋白条带灰度值/内参灰度值表示。本研究以Actin为内参。

2 结果

2.1 不同浓度百里醌类似物ATQTHB对A549细胞增殖的影响：分别采用浓度为18.75、37.5、75、150、200、300、400、600 μg/mL的ATQTHB溶液作用于A549细胞，CCK-8结果表明，各个浓度均具有显著抑制肿瘤细胞增殖作用(P<0.05)。浓度在18.75～300 μg/mL，抑制细胞增殖程度在各浓度之间差异无统计学意义(P>0.05)。当百里醌类似物ATQTHB浓度为400 μg/mL时，肺癌A549细胞增殖抑制作用强于300 μg/mL，差异有统计学意义(P<0.05)；浓度在400～600 μg/mL时差异无统计学意义(P>0.05)，ATQTHB最佳抑制细胞增殖浓度应为400 μg/mL，无显著剂量依赖性，见图1(目录后)。

2.2 百里醌类似物ATQTHB具有抑制A549细胞增殖的作用：采用上述最适浓度400 μg/mL ATQTHB分别干预肺癌A549细胞和人正常肺上皮细胞BEAS-2B，结果表明，与A549细胞组相比，ATQTHB干预对A549细胞增殖具有显著抑制作用(P<0.05)；而ATQTHB干预后，人正常肺上皮细胞BEAS-2B增殖具有下降趋势，但与未干预组比较差异无统计学意义(P>0.05),见图2(目录后)。

2.3 流式检测ATQTHB对A549细胞凋亡的影响：与A549组相比，A549+ATQTHB 400 μg/mL干预组的A549细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)；与BEAS-2B组相比，BEAS-2B+ATQTHB 400 μg/mL干预组的细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)，见图3(目录后)。

2.4 Western blot检测细胞凋亡结果：与A549细胞组相比，A549细胞+ATQTHB 400 μg/mL干预组的抑制凋亡蛋白Bcl-2表达显著减少(P<0.05)，而促凋亡蛋白Bax表达水平显著增加(P<0.05)；与BEAS-2B细胞组相比，BEAS-2B+ATQTHB组两种蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见图4(目录后)。

3 讨论

百里醌具有明显的抗肿瘤效应，但因百里醌的半数抑制浓度(IC50)过高，成为其向药品研发过程中的瓶颈，因此学者们把百里醌抗肿瘤的研究转向了百里醌类似物[7]。本研究旨在评价百里醌类似物ATQTHB对肺癌细胞增殖的作用。研究发现ATQTHB能够显著抑制人肺癌A549细胞的增殖，最适浓度为4 00 μg/mL，并且呈现剂量的非依赖性。ATQTHB能够抑制肺癌细胞的增殖，这与之前文献中报道的百里醌类似物ATQTHB对乳腺癌具有较好的抑制作用的结果一致[8]。但是为何会出现剂量非依赖性、以及百里醌类似物的毒副作用等诸多问题尚不清楚，需要后续实验支撑。

为了更好地分析ATQTHB的抑制增殖作用是针对肺癌细胞而非针对正常肺上皮细胞，本研究采用两种细胞同时开展400 μg/mL ATQTHB干预实验，发现ATQTHB能有效抑制肺癌细胞增殖，而对正常肺上皮细胞增殖没有明显抑制作用，提示ATQTHB如果用于治疗肺癌，可能会在产生较小副作用的情况下发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。有研究表明，ATQTHB可明显诱导人胰腺癌细胞系BxPC-3的凋亡[1]。也有文献报道，百里醌能够通过调控趋化因子和炎症因子的释放而发挥抗肿瘤作用[9]。此外，百里醌有效成分能够有效调节肺损伤的氧化应激[10]，而该抗氧化应激作用可能是基于Nrf-2途径实现的[11]。本研究中涉及的具体机制仍需要在接下来的研究中阐明。为了进一步说明ATQTHB导致癌细胞增殖抑制的原因，本研究检测了细胞凋亡率。结果表明，ATQTHB可通过促进A549细胞凋亡发挥抑制肺癌细胞增殖的作用，这与之前文献中报道的百里醌对其他肿瘤的作用相类似[12-13]。研究表明，纳米组成的百里醌活性成分对于胰腺癌细胞的增殖具有显著抑制作用[12]。而另一项研究也发现，百里醌的衍生产物具有抗乳腺癌的作用[13]。

本研究检测了凋亡相关分子Bcl-2和BAX，结果表明，ATQTHB能够减少A549细胞抑制凋亡的Bcl-2、增加促凋亡的BAX的表达量，进一步表明ATQTHB可通过调控Bcl-2与BAX促进肺癌细胞凋亡，从而抑制肺癌细胞增殖。在一项针对SK-OV-3卵巢癌细胞的研究中发现，百里醌活性成分能够通过调节Bcl-2和Bax促进细胞的凋亡[14]。百里醌类似物能够通过促进凋亡而抑制直肠癌细胞Caki-1的增殖，而其机制与JAK2/STAT3介导的Bcl-2和Bax调控有关[15]。本研究中涉及的凋亡具体相关分子通路机制，仍需要后续进一步研究去证实。