miR-216a调控气道炎症参与慢性阻塞性肺疾病进展的机制研究

贺 霞，王 铎，陈 瑶

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是世界范围内发病率和死亡率最高的疾病之一，吸烟被认为是 COPD 的最大危险因素，并且是导致气道炎症的最关键因素[1-3]。慢性炎症导致气道结构变化、小气道变窄和肺实质破坏，导致进行性气流受限，然而其具体机制尚不明确。MicroRNA(微小核糖核酸，miRNA)是小的内源性非编码RNA分子，由19～25个核苷酸组成，它们可以通过降解目标信使RNA(mRNA)或抑制蛋白质翻译来调节基因表达，从而参与转录后水平的生理和疾病过程[4]。研究表明，miRNA 可能通过调节炎症相关基因的表达在 COPD 的发病机制中发挥重要作用[5]，miR-216a在肺癌中发挥重要作用[6-7]，其在慢性气道炎症性疾病如 COPD 中的作用尚未研究。本研究主要探讨miR-216a在COPD中的作用及潜在调控机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料:所有受试者均为2020年1月至2020年12月在本院就诊且接受肺肿块手术的COPD患者作为观察组，共26例，均为男性，年龄(63.2±1.3)岁；收集同期年龄和性别匹配的非吸烟者和没有COPD的吸烟者作为对照，其中非吸烟者10例(除无吸烟史，其他纳入及排除标准同上)，均为男性，年龄(59.3±2.4)岁；另一组为没有COPD的吸烟者24例，均为男性，年龄(60.9±1.6)岁。3组患者性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获本院伦理委员会审批，患者均签署知情同意书。纳入标准：符合COPD诊断标准；年龄40～75 岁；吸烟>20包/年且有5年以上吸烟史。排除标准：慢性肺部疾病，如哮喘、支气管扩张和肺纤维化；心脏、肝或肾功能衰竭；活动性结核病；肺癌；目前有吸入或口服类固醇治疗者。

1.2 方法

1.2.1 肺功能检查:在吸入β-激动剂(沙丁胺醇)之前和之后20 min，使用适当校准的肺活量计从流量-体积曲线中获得第1秒的用力肺活量和用力呼气量(FEV1.0)。预测 FEV1.0使用美国胸科学会/欧洲呼吸学会工作组推荐的预测方程计算：预测FEV1.0=4.30×身高(m)-0.029×年龄-2.49。

1.2.2 样本收集:收集所有患者手术切除期间肺组织(距病灶至少 5 cm)，用福尔马林固定并石蜡包埋或均质并储存在-80 ℃。

1.2.3 荧光原位杂交:通过肺组织进行荧光原位杂交，使用 miRCURY LNA microRNA ISH 优化试剂盒(福尔马林固定石蜡包埋；Exiqon，Vedbaek，丹麦)和TSA PLUS 荧光试剂盒(PerkinElmer，Waltham,MA)。使用对 miR-216a(Exiqon)特异的双(5′和 3′)地高辛标记的核酸探针，在连续多轮辣根过氧化物酶介导的酪胺信号放大反应后，探针/靶标复合物可视化。乱序探针用作阴性对照。

1.2.4 免疫组织荧光：将肺切片脱蜡，再水化并进行热诱导表位修复。封闭后，切片与 BRD4 兔单克隆抗体(A700-004，Bethyl，Montgomery，TX)在4 ℃下孵育过夜。洗涤后，将切片与 DyLight 594缀合的山羊抗兔IgG(Abbkine，Redlands，CA)在室温下避光孵育1 h，然后洗涤并盖上带有DAPI的Vectashield HardSet封固培养基。

1.2.5 香烟烟雾提取物(CSE):将2支没有过滤器的3R4F研究香烟的烟雾，以1支香烟/5 min的速度冒泡到含有20 mL培养基的 50 mL锥形管中而制成。提取物通过 0.22 μm过滤器过滤，并被视为100%强度CSE。

1.2.6 细胞培养:人支气管上皮(HBE)细胞系 HBE4-E6/E7(ATCC,CRL-2078)用于所有细胞实验。细胞在 RPMI 1640培养基中培养，并在 37 ℃、5% CO2的加湿培养箱中添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素，细胞用5% CSE 处理24 h。在转染实验中，使用 Lipofectamine 3 000(Invitrogen，Carlsbad，CA)将miR-216a 模拟物、抑制剂、非靶向对照、BRD4 siRNA 或乱序对照(RiboBio，广州，中国)转染细胞。在N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理实验中，细胞用 1 mM NAC(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)预处理 2 h，然后用5% CSE处理24 h。

1.2.7 荧光素酶活性测定：携带野生型突变BRD4 3’-UTR 或无3’-UTR(对照)的载体与miR-216a模拟物，或非靶向对照共转染到HBE4-E6/E7细胞中，通过双荧光素酶报告基因检测系统(Promega,Madison,WI)检测荧光素酶活性。将萤火虫荧光素酶活性标准化为海肾荧光素酶活性。

1.2.8 定量PCR：使用 miRNeasy Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA)从肺组织或HBE4-E6/E7细胞中提取总 RNA。对于microRNA定量PCR，使用TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒和microRNA特异性RT引物(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)逆转录总RNA。使用microRNA特异性TaqMan探针和TaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems)进行定量 PCR。肺组织和HBE4-E6/E7细胞中miR-216a的相对表达使用2-ΔΔCt方法确定，U6 作为内源性对照。为了定量 mRNA 表达，逆转录总 RNA，并使用SYBR Premix Ex Taq(Tarkara，Shiga，Japan)进行PCR。引物序列如下：BRD4(5’-CCCCTCGTGGTGGTGAAG-3’和5’-GCTCGCCTGCGGATGATG-3’)、IL-8(5’-AAGAAAACCACCGGAAGGAAC-3’和5’-ACTCCTTGGCAAAACTGCAC-3’)和IL- 6(5’-CTGCCTGCCTTCCCTGCC-3’ 与5’-CCTCTTTGCTGCTTTCACACAT-3’)。使用 2-ΔΔCt方法以18S rRNA作为内源对照测定相对mRNA表达。

1.2.9 Western blot：制备HBE4-E6/E7细胞裂解物，并使用二辛可宁酸测定法(Aspen，Wuhan，China)测定总蛋白浓度，在SDS-PAGE凝胶上分离等量的样品蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯膜上。封闭后，将膜与一抗 [BRD4 兔单克隆抗体(目录号 A700-004，Bethyl，Montgomery，TX)和 GAPDH 小鼠单克隆抗体(Sungene，天津，中国)] 在4 ℃下孵育过夜，洗涤，然后与二抗(辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG或抗小鼠 IgG；Aspen)室温孵育1 h。根据制造商的说明，使用化学发光程序(Clarity Western ECL Substrate；Bio-Rad，Hercules，CA)检测免疫反应信号。

2 结果

2.1 miR-216a在COPD肺中的表达:通过定量PCR(qRT-PCR)检测非吸烟者、吸烟者和吸烟COPD患者肺组织中miR-216a的表达，与非吸烟者相比，吸烟者肺中miR-216a表达显著降低(P<0.05)，吸烟COPD患者肺中miR-216a表达进一步降低(P<0.05)。此外，通过荧光原位杂交发现，与非吸烟者相比，吸烟者支气管上皮细胞中miR-216a的表达降低(P<0.05)，而在吸烟 COPD 患者中进一步降低(P<0.05)，见表1。

2.2 COPD患者肺组织miR-216a与肺功能和炎症的相关性:吸烟COPD患者肺miR-216a水平与FEV1%pred 呈正相关性(r=0.4882,P<0.05)。与非吸烟者相比，吸烟者肺中IL-8和IL-6均增加，而COPD患者肺中的IL-8和IL-6进一步增加，见表2。COPD患者肺miR-216a水平和IL-8水平之间存在显著负相关性(r=-0.4677,P<0.05)，miR-216a 和IL-6之间无相关性(r=-0.3372,P>0.05)。

2.3 BRD4 基因是miR-216a 的靶标：通过PicTar、miRanda和miRWalk预测miR-216a的靶基因，发现BRD4是miR-216a的候选靶点之一。为了验证BRD4与miR-216a的靶向关系，检测分别转染miR-216a模拟物与抑制剂的HBE4-E6/E7细胞中的BRD4表达，发现用miR-216a模拟物转染后BRD4mRNA和蛋白质水平降低，而用miR-216a抑制剂后表达增加。双荧光素酶报告基因检测证实了miR-216a与BRD4 3′-UTR的结合(图1，目录后)。

2.4 miR-216a靶向 BRD4 调节CSE诱导HBE4-E6/E7细胞的IL-8表达:为了研究miR-216a在气道上皮细胞中的作用，培养HBE4-E6/E7细胞并用5%CSE刺激，显示CSE显著降低miR-216a的表达(图2，目录后)。CSE处理后BRD4表达增加，然而转染miR-216a模拟物过表达miR-216a抑制了CSE诱导的BRD4上调。为了检查miR-216a是否通过靶向BRD4调节HBE4-E6/E7细胞的IL-8表达，用miR-216a模拟物和(或)BRD4 siRNA 转染HBE4-E6/E7细胞，发现CSE诱导的BRD4表达被miR-216a模拟物和(或)BRD4 siRNA 的转染抑制(图3、图4，目录后)。在HBE4-E6/E7细胞中，CSE处理后IL-8表达增加，并且 BRD4 表达的敲低或miR-216a的过表达抑制了CSE诱导的IL-8表达。CSE处理后IL-6表达也增加，然而，BRD4 表达的敲低或miR-216a的过表达不会改变CSE诱导的IL-6表达。

3 讨论

尽管miRNAs在肺部疾病发病机制中的作用逐渐被揭示，并且miRNAs可能参与肺部炎症的调节。目前，miR-216a在肺癌中的作用被广泛研究，但关于miR-216a在慢性气道炎症性疾病(如COPD)中的作用知之甚少。本研究结果显示，miR-216a在吸烟者肺中的表达降低，在COPD患者肺中进一步降低(P<0.05)。此外，本研究结果提示COPD患者肺miR-216a表达与肺功能呈正相关性，miR-216a可能在COPD的发病机制中起着重要作用。

COPD与主要影响肺实质和外周气道的慢性炎症有关，这导致在很大程度上不可逆和进行性气流受限[8]。COPD患者肺部的炎症涉及先天性和适应性免疫细胞，但也有结构细胞的激活，如气道上皮细胞。这些细胞分泌多种促炎介质，包括细胞因子、趋化因子、生长因子和脂质介质。上皮细胞被香烟烟雾和其他吸入刺激物激活，产生炎症介质，包括IL-6和IL-8[9-12]。本研究结果显示，吸烟者肺中IL-6和IL-8 mRNA表达水平升高，COPD患者肺中进一步升高，且肺miR-216a水平与IL-8水平密切相关(P<0.05)。此外，荧光原位杂交显示，吸烟者气道上皮细胞中miR-216a减少，COPD患者气道上皮细胞中miR-216a进一步减少，提示miR-216a可能参与了COPD的气道炎症。

BRD4是一个关键的转录和表观遗传调控因子[13-16]。本研究发现其是miR-216a的靶标。体外研究表明，CSE刺激导致支气管上皮细胞中miR-216a表达降低和BRD4表达增加，CSE刺激后IL-8 mRNA表达水平增加，但当miR-216a过表达和(或)BRD4表达被敲低时降低。结果表明miR-216a可能通过靶向BRD4调节支气管上皮细胞中炎性细胞因子的表达，从而导致COPD的气道炎症。

综上所述，本研究显示COPD患者肺中miR-216a表达降低，并且miR-216a降低与肺功能和炎症有相关性；BRD4是miR-216a的靶点，在COPD患者的肺中升高，并与miR-216a和IL-8表达相关；miR-216a在体外通过靶向支气管上皮细胞中的BRD4调节CSE诱导的IL-8表达，结果表明miR-216a可能通过靶向BRD4调节炎性细胞因子表达参与了COPD气道炎症。