AFP阴性肝癌早期诊断的蛋白分子标志物

2022-11-26舒宏

中国实验诊断学 2022年7期

舒宏

(广西医科大学附属肿瘤医院检验科,广西南宁530021)

原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见恶性肿瘤之一，因发病隐匿且进展迅速，超过80%的肝癌患者在确诊时已发展为中、晚期，甚至失去手术治疗的机会。未能在肝癌早期确诊并采取有效治疗措施，是导致肝癌患者预后较差、病死率高是主要原因[1-2]。因此，早发现、早诊断、早治疗能有效提高肝癌患者生存率，改善患者的生存质量。目前，临床最常用肝癌的血清学标志物是甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)，但其灵敏度和特异度并不令人满意，大约80%的小肝癌患者血清中的AFP表达为阴性，无法与良性肝病相鉴别[3]。因此，AFP在肝癌的早期筛查中具有明显的局限性，迫切需要寻找更特异、更敏感的肝癌，尤其是小肝癌早期诊断的血清学标志物。随着生物学技术的发展，新的血清学标志物不断被发现，本文就AFP阴性早期肝癌诊断有价值的血清肿瘤标志物分子进行综述。

1 已在临床上应用的AFP阴性肝癌标志物

1.1肝癌三联检肝癌三联检，包括异常凝血酶原(DCP)、甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体比率(AFP-L3%)，是最早应用在临床上的诊断AFP阴性HCC的标志物组合。美国食品药品管理局于2005年批准AFP-L3作为肝癌预警的血清学标志物，并将AFP-L3/AFP>10%定义为阳性，提高了肝癌早期诊断灵敏度。DCP是在AFP阴性的肝细胞癌患者因维生素K缺乏，引起凝血酶原前体羧化不全，从而大量产生。DCP诊断肝细胞癌的受试工作者特征曲线下面积(AUROC)为0.86[4]。DCP、AFP和AFP-L3%相互补充[5]，联合检测敏感度和特异度分别为83.0%和75.0%，能有效减少AFP阴性肝癌的漏诊。

1.2热休克蛋白90α(HSP90α) HSP90是热休克蛋白家族的一员，Hsp90α是其中HSP90的一种亚型。Fu等发现[6]，Hsp90α同肝癌的发生和恶性程度密切相关，且临床诊断的特性和灵敏性高达90%以上，对癌症分级和预后有重要意义。该标志物已经获得CFDA批准，在临床推广应用。

2 新型AFP阴性肝癌标志物

2.1 蛋白分子

2.1.1骨桥蛋白(OPN) OPN是一种能与整合素和CD44受体家族相结合的分泌性磷蛋白，在肿瘤细胞的黏附、迁移、浸润和血管新生中起重要作用。一项研究表明[7]，HCC患者血清OPN水平明显高于良性慢性肝病患者，用于诊断HCC的AUROC为0.87。在另一项研究中也得到了类似的结果，诊断AFP阴性HCC的AUROC为0.838，敏感性为78.3%，特异性为79.6%[8]。以上结果表明，OPN对AFP阴性的HCC有良好的敏感性。此外，在HCC患者诊断前两年内，87%的患者血清中OPN的水平均高于临界值，表明OPN还可用于临床前肿瘤预测[7]。

2.1.2中期因子(MDK) MDK是一种肝素结合生长因子，参与肿瘤细胞生长、侵袭和血管生成。Zhu等研究表明[9]，MDK在肝细胞癌组织和血清样本中均显升高，在AFP阴性肝癌患者中，MDK对AFP阴性HCC诊断的敏感性高达89.2%。另一项Meta分析结果也证实[10]，MDK诊断AFP阴性HCC的灵敏度为88.5%，特异性为83.9%，AUROC为0.91。以上研究表明，MDK可作为诊断AFP阴性HCC的新型标志物。

2.1.3Dickkopf1蛋白(DKK1) DKK1是一种调节Wnt信号通路的重要分子。在一项大规模、多中心验证研究中发现，与健康对照组、HBV感染患者和肝硬化患者相比，DKK1在HCC患者血清中表达水平显著增高，对AFP阴性的HCC诊断的敏感度和特异度分别为70.4%和90.0%，AUROC为0.841。表明DKK1能有效区分HCC与非恶性慢性肝病，提高AFP阴性HCC的诊断效率[11]。

2.1.4可溶性酪氨酸蛋白激酶受体(sAX1) sAX1是一种细胞表面的跨膜受体，与相应配体结合后发生磷酸化，激活下游信号通路，发挥促进细胞生长、迁移、聚集和转移等生物学功能。Reichl等[12]通过分析来自多中心的237份对照血清样本和311份AFP阴性HCC血清中sAxl表达水平，发现HCC患者血清中sAxl的表达水平显著升高，其诊断AFP阴性HCC患者的AUROC为0.803，敏感性和特异性分别为73%和70.8%。同时，最近的一项研究也证实[13]，sAxl诊断AFP阴性HCC的AUROC为0.898，敏感性为84.6%，特异性为76.3%。这些研究结果表明，sAxl是AFP阴性HCC的有效诊断生物标志物。

2.1.5醛酮还原酶家族1成员B10(AKR1B10) AKR1B10是一种分泌蛋白，在肝细胞癌(HCC) 中高表达。在一项1244人参与的大规模多中心研究中发现，HCC患者的血清AKR1B10水平显着高于非HCC患者。其诊断AFP阴性HCC的AUROC为0.891,敏感度是71.2%，特异度为92.6%，并且在早期AFP阴性HCC中也有类似的诊断性能(AUROC0.839，敏感性 63.4%，特异性 90.7%)。因此，AKR1B10可作为检测早期AFP阴性HCC有效血清标志物[14]。

2.2 岩藻糖基化糖蛋白

在肝癌的发生发展过程中，蛋白的糖基化的改变是普遍存在的，岩藻糖基化改变是聚糖结构变化的重要形式之一，与肿瘤的生长、侵袭、转移、免疫抑制等密切相关，可以作为肿瘤诊断、治疗和预后的标志物[15]。

2.2.1岩藻糖基化的α-1酸性糖蛋白(Fuc-AGP) AGP是一种主要由肝细胞合成的急性期糖蛋白，根据病理生理条件具有不同的糖类形式，多种岩藻糖基化AGP可作为肝癌的新生物标志物[16]。Liang等[17]发现AGP的三岩藻糖基化N-聚糖仅存在于HCC患者中，能有效区分肝硬化与AFP阴性的HCC，诊断AFP阴性的HCC的AUROC为0.709，敏感性为52%，特异性为80%，表明AGP可作为诊断AFP阴性肝癌的潜在标志物。

2.2.2岩藻糖基化的免疫球蛋白G(Fuc-IgG) 免疫球蛋白在肝癌发生发展过程中，可能参与体液免疫调节，免疫球蛋白的蛋白水平和糖基化结构发生改变，如IgG的FC段。Yi等[18]发现，Fuc-IgG-L3在健康志愿者、HBV携带者、肝硬化患者和HCC患者血清中，IgG-L3%逐渐增加，对APF阴性肝癌诊断AUROC为0.795，敏感性为80.5%，特异性为70.0%。表明IgG-L3%可能是HBV相关性肝癌有价值的潜在诊断和预后标志物。

2.2.3 岩藻糖基化结合珠蛋白(Fuc-Hp)本课题组前期发现，肝硬化和肝癌患者血清Hp-β链内含有大量的Lewis X识别的岩藻糖结构[19]。Shang等[20-22]运用凝集素磁珠的Fuc-Hp检测系统，发现Fuc-Hp含量在AFP阴性HCC血清中显著升高，AUROC、特异性、灵敏度和准确度分别为0.929，93.3%，80.8%和84.0%，表明Fuc-Hp对AFP阴性肝癌有良好的预测和诊断效能。

2.2.4岩藻糖基化的血清对氧磷酯酶1(Fuc-PON1) Sun等[23]早期利用了识别末端岩藻糖的凝集素串联亲和层析的方法富集糖蛋白，并用质谱鉴定筛选出差异的糖蛋白PON1，发现Fuc-PON1有望成为诊断早期肝癌的糖组学标记物。Zhang[24-25]采用凝集素ELISA方法证实Fuc-PON1能有效区分AFP阴性的早期HCC和AFP阴性的肝硬化，AUROC为0.850，诊断AFP阴性的早期HCC的敏感性为90%，特异性为75%，明显好于70例AFP阳性患者的检测结果。以上研究表明，Fuc-PON1可作为AFP阴性肝癌的糖标志物。

3 多种标志物分子联合检测

虽然，新的HCC诊断标志物层出不穷，但至今为止，尚未实现单一标志物精准诊断。因此，科学地推进多种标志物联合检测及检测方法的标准化，是实现HCC的早诊断、早治疗的有效途径。

3.1 GALAD评分有研究表明[26]，GALAD评分系统的5个指标(年龄、性别、AFP-L3、AFP和DCP)有助于早期 HCC筛查和诊断。该模型对诊断AFP阴性肝癌的敏感性为67.5%，特异性超过90%。

3.2 纤维蛋白原与前白蛋白比值(FPR)和γ-谷氨酰转肽酶与血小板比值(GPR)组合Huang等人[27]还发现，FPR和GPR水平在AFP阴性HCC的发展过程中逐渐升高，与肿瘤大小和巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分期呈正相关，两者联合能够有效地诊断AFP阴性肝癌，AUROC为0.977。

3.3 七种自身抗体的组合本课题组近期利用蛋白芯片[28]，采用三阶段策略识别血清自身抗体特征，经过严格的测试验证发现7个自身抗体分子(CIAPIN1、EGFR、MAS1、SLC44A3、ASAH1、UBL7和ZNF428)，通过建立的神经网络(ANN)模型确定它们检测AFP阴性HCC的诊断效能(AUROC值为0.841-0.948)。特别对于BCLC 0/A期的AFP阴性HCC，其AUROC约增加10%。

3.4 岩藻糖基化激肽原(Fuc-KNG)与常规实验室检测指标联合Wang等[29]人发现，与肝硬化患者相比，肝癌患者的岩藻糖基化水平升高，并开发了一种Doylestown算法的诊断模型，将Fuc-KNG与年龄、性别、血清碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转氨酶水平和AFP相结合，用于预测肝癌发病率。该模型检测AFP阴性HCC患者的AUROC为0.970，真阳性率为89%，而AFP的AUROC为0.597，真阳性率为0%，假阳性率为5%，比以前简单临床指标的模型具有更好的诊断性能。