马病毒性动脉炎实验室诊断技术研究进展

王金慧，胡 哲，李帅杰，张泽楠，王晓钧

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨 150069)

马病毒性动脉炎(Equine viral arthritis,EVA)是由马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)引起的一种马属动物传染病，主要侵害动物的呼吸系统和生殖系统。发生EAV感染时，大部分为亚临床症状。急性感染的动物可能会有一系列临床症状的出现，比如发热、抑郁和呼吸窘迫等。EAV感染可引起孕马流产，感染母马的流产率在10%～70%之间。原发感染后，有70%的种马可以被持续感染，并通过精液排毒，有时会变成终生带毒[1-2]。以马病毒性动脉炎症状为特征的疾病最先暴发于美国俄亥俄州Bucyrus附近的标准化育种场，从该育种场流产胎儿的肺中分离到第一株EAV,命名为Bucyrus株[3]。后来该病在全世界流行，血清学调查发现在北美、南美、欧洲、澳大利亚和非洲都发生过EAV感染。在美国，成年标准种马EAV的血清阳性率达70%～90%[4]。据我国2012年文献报道，华南地区赛马EAV的血清阳性率为26%，华中地区赛马的血清阳性率为0，东北地区役用马的血清阳性率为8.26%，西北地区役用马的血清阳性率为7.55%[5]。近年来，随着经济的发展，马匹贸易交流日益频繁以及马病无疫区建设的需要，马病毒性动脉炎的诊断越来越受到关注。

EAV为单股正链RNA病毒，属于套式病毒目、动脉炎病毒科。其基因组编码多种结构蛋白和非结构蛋白，其中，结构蛋白GP5为主要产生中和抗体的蛋白。非结构蛋白N蛋白是产生抗体最多的蛋白也是最保守的蛋白[6]。GP5蛋白和N蛋白成为血清学检测和病原学检测的主要靶标蛋白。血清学检测和病原学检测都是实验室常用的检测技术，本文对EAV实验室常用的检测技术进行综述。

1 检测技术

1.1 病毒分离鉴定

当怀疑老龄马死于EAV感染时，可以从肺、肝和脾，特别是消化道外周淋巴组织中分离病毒。在流产和死胎病例中，胎盘、淋巴网和胎儿组织都可以成为病毒的复制场所[7]。短期和长期携带EAV的种马则需取其精液进行病毒分离。病毒分离可使用选定的细胞系，例如RK-13(ATCC CCL-37)、LLC-MK2(ATCC CCL-7)和原代马或兔肾细胞。在低病毒感染性的样本中，使用高传代的RK-13细胞可提高EAV的分离率。不同样本的接种前处理不同，拭子样本用0.45 μm的滤膜过滤除菌，若样本是全血则取外周血单核细胞进行病毒分离。将样品处理好后接种于RK-13单细胞层中，每天坚持观察是否出现细胞病变(CPE)，CPE变通常在2 d～6 d内出现，若没有可见CPE，培养上清液在5 d～7 d后接种到RK-13单层细胞中。EAV分离株可以通过RT-PCR或实时RT-PCR等来鉴定。病毒分离是OIE批准的EAV检测“金标准”[4]，适合用于EAV感染后疾病暴发的确诊。但是该方法耗时长，对样品要求较高，不适用于大规模检测。

1.2 抗原捕获酶联免疫吸附试验

国际上针对EAV病原的检测方法比较少，戚亭等[8]利用EAV N蛋白的2株单克隆抗体建立了抗原捕获酶联免疫吸附试验(AC-ELISA)，其原理是先将捕获抗体加到固相载体上，加入待检抗原与之结合形成抗原抗体复合物，再加入检测抗体并利用底物显色。该方法对EAV的最低检测限度可达36 PFU，可以实现对病毒的定量分析，实现对病毒抗原的快速检测。

1.3 病毒核酸检测技术

1.3.1 实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应 荧光定量可以通过收集反应过程中产生的荧光信号来实时监测整个扩增过程，并对样本的初始模板含量进行定量。根据产生荧光信号物质的不同，该方法可分为染料法和探针法。实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应(RT-qPCR)敏感性高，特异性强，被广泛应用于病毒检测。 Balasuriya U B R等[9]、Westcot D G等[10]和Manko S等[11]先后根据开放阅读框7(ORF7)的保守基因序列设计引物和探针，分别建立检测EAV的RT-qPCR方法。以上3种方法均被OIE列为推荐的EAV检测方法。Westcot D G等建立的方法敏感性与病毒分离相当。Balasuriya U B R等和Manko S等建立的方法(T1和T2)最低检测限度分别为10个分子的病毒RNA和0.68 PFU/mL的病毒样本。Lu Z C等[12]利用T1和T2两种方法检测不同类型的样本以比较它们的敏感性。检测155份组织培养上清样本，与病毒分离相比，T1的检出率为100%，T2的检出率为95.2%。T1敏感性高于T2。检测300份精液样本，与病毒分离相比，T1的检出率为93.4%，T2的检出率为42.6%。T1的敏感性要高于T2，但仍然低于病毒分离。Miszczak F等[13]结合两种不同的核酸提取方法以进一步比较T1和T2在检测精液样本中的敏感性。通过选择不同的核酸提取试剂和PCR反应试剂，T1的敏感性可以达到病毒分离的敏感性水平，甚至是更为敏感的水平。Hans A等[14]把基本无偏差扩增与OIE推荐的RT-qPCR方法结合起来。首先把提取的样本RNA反转录成cDNA，用Phi29聚合酶进行等温扩增，然后按照OIE推荐的RT-qPCR方法进行检测，这种结合可以提高检测EAV RNA的敏感性，且没有损失特异性。改进后的方法适用于检测精液和流产胎儿样本，特别是病毒滴度很低的样本。杜建[15]和梁成珠[16]先后根据EAV N蛋白设计引物和探针，建立了TaqMan探针法实时荧光定量RT-qPCR，后者建立的方法最低可检测到5 PFU/100 μL。胡月[17]针对ORF7区域设计了1对引物，建立了Eva Green RT-qPCR检测方法，该方法能检测出EAV的最低毒价为101.5TCID50/mL，能检测到的最低拷贝数为10拷贝/μL。总之，荧光定量PCR具有敏感性高，特异性强，结果判读简便的特点，是目前广泛应用于检测的方法之一。然而，不可否认的是，该反应的进行要利用昂贵的仪器，对操作人员的要求较高，可能正是因此限制了其在部分资源匮乏地区的应用。

1.3.2 恒温隔绝PCR 恒温隔绝PCR(insulated isothermal PCR,iiPCR)是一种基于POCKITTM系统的方法，这是在通过管底端加热的毛细管中完成的。这种方法需要通过凝胶电泳进行信号检测，限制了iiPCR的应用。后来进一步发展为基于TaqMan探针的iiPCR系统，把光学检测模块集成到iiPCR装置中，用于检测探针产生的荧光信号。此外，它还提供了使用默认算法自动解释结果的功能，可直接得到阴性和阳性结果，无需按照RT-qPCR分析的要求进行手动数据分析。Carossino M等[18]针对EAV基因高保守区ORF7设计引物，建立一种RT-iiPCR方法可以检测精液和组织样本中的病原，用此方法检测125个精液样本，敏感性和特异性分别为100%和98.33%。检测122个流产胎儿、马驹和携带EAV种马的组织样本，其敏感性和特异性分别为98.31%和92.06%。对EAV RNA最低检测限度为10个拷贝。此方法耗费时间少(<1 h)，操作简单，适合应用于马场的临床检测。便于对流产疫情的快速诊断和赛马场呼吸道疾病快速诊断。

1.3.3 套式PCR 套式PCR是利用2对PCR引物对DNA进行扩增的方法，第2对引物的位置设计在目的片段的内部，结合到第1对引物扩增的片段上开始第2轮扩增，提高了PCR反应的特异性。Gilbert S A等[19]根据EAV ORF1b基因序列的高保守区设计了套式PCR引物。最低检测限度可能小于0.25 PFU/mL或2.5 PFU/mL。此方法相对于病毒分离试验来说，检测88份精液样本，敏感性和特异性分别为100%和97%，适合用于低病毒含量的样本检测。操作时应小心避免气溶胶造成环境污染。

1.3.4 逆转录-环介导等温扩增 逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)是一种利用特殊设计的引物和具有链置换活性的的DNA聚合酶在60 ℃～65 ℃恒温条件下，进行核酸扩增的方法。可以在反应液中加入pH指示剂，直接通过颜色变化来判断是否发生扩增。黄素文[20]针对M基因设计了特异性引物，建立了EAV的RT-LAMP检测方法。该方法的敏感性为12 pg，特异性良好，1 h即可完成反应。RT-LAMP方法耗费时间少，不需要昂贵的仪器，操作简便，结果判读简单，适合用于EAV的核酸快速检测，但也要注意气溶胶污染造成的假阳性。

2 血清学诊断技术

2.1 病毒中和试验

马动脉炎病毒的病毒中和试验(virus neutralization test,VNT)可用于疑似样本和EAV暴发的确认。目前广泛应用的中和试验程序是由美国农业部国家兽医服务实验室建立的，建议用CVL-Bucyrus作为参考毒株，在RK-13细胞中进行试验。McCollum W H[21]提出了一种噬斑减少中和试验。Fukunaga Y等[22]研究发现在病毒悬液中加入100 mL/L的豚鼠血清，可以提高免疫后任何阶段的中和试验滴度。VNT可以用于马病毒性动脉炎的诊断，流行病学监测，国际贸易检测，免疫接种前、后的抗体检测。此方法的优点为敏感性高，特异性强，但需要较强的操作能力，并且耗费的时间较长，而且其敏感性会受多种因素影响，其中EAV病毒株的来源和传代史对VNT的检测结果影响比较大。

2.2 血凝和血凝抑制试验

含有血红素结构的抗原可与鸡或者人等的红细胞发生血凝(hemagglutination,HA)。加入该抗原的抗体，则会抑制红细胞的凝集，这种现象称为血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)反应。Kubota T等[23]发现了EAV的HA现象。用感染Bucyrus毒株的RK-13细胞培养物作为抗原，发现可以使小鼠红细胞凝集，但是凝集滴度低。同时还发现，用吐温-80乙醚(TE)处理细胞或者用TE处理细胞上清液获得的抗原凝集价高于未用TE处理的抗原凝集价。用TE处理过的细胞得到的抗原可使ddY小鼠、Balb/c小鼠和鸡红细胞分别在4 ℃、室温和37 ℃发生凝集，而不能使马、牛、豚鼠、沙土鼠、鹅和10日龄鸡胚红细胞发生凝集。将血清和抗原分别在37 ℃孵育1 h、4 ℃孵育24 h或48 h，然后用HI测定感染Bucyrus病毒株的马血清中的抗体效价。结果表明,血清HA抗原混合物在4 ℃孵育24 h时，HI检测的敏感性最高。检测结果与中和试验相比，HI最早检测出抗体的时间比中和试验晚1周，且检测出的抗体滴度比中和试验略低[23]。

2.3 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)利用抗原与其特异性抗体结合的基本免疫学概念，可以检测抗原或液体样本中的抗体。将抗原或抗体结合在固相载体中，通常在96孔微量板中，再用酶标记的抗原抗体检测生物分子与之结合，利用酶的显色反应产生可见的颜色变化或荧光，指示抗原抗体是否存在[24]。Cho H J等[25]用病毒感染的细胞上清进行差速离心，再用Trition X-100处理，制备出高效抗原。利用此抗原和EAV GP5蛋白的单克隆抗体建立阻断ELISA检测马血清中的抗体。相比于中和实验，检测320份样本，该方法的敏感性为99.4%。检测517份样品，特异性为97.7%。由于中和抗体滴度高的血清会受前带反应的影响，因此用阻断ELISA方法检测时，应在血清样本未稀释和稀释10倍两种情况下进行。Chung C等[26]将上述ELISA方法中用到的GP5蛋白中和域单克隆抗体替换为GP5蛋白的非中和域单克隆抗体，检测246份中和试验阳性样本，敏感性为95.5%。检测2 223份中和试验阴性样本特异性为99.8%。该方法在应用时，仍不会受到血清暴露于非EAV生物制剂的影响，可以检测EAV疫苗免疫马和EAV感染马中的特异性抗体。他们又用阴离子色谱交换法代替差速离心法纯化抗原，其敏感性为98.2%，特异性为99.5%。相比于Chung C等[27]改进后的方法，提高了敏感性，而特异性没有改变，使得该方法与病毒中和试验检测结果的一致率提高30%～40%。Nugent J等[28]根据EAV毒株Bucyrus GP5蛋白的81-106氨基酸建立间接ELISA方法，敏感性为96.75%，特异性为95.6%。 Metza G E等[29]根据阿根廷EAV基因序列，设计表达GP5蛋白C表位(67-90氨基酸)作为包被抗原，建立了检测EAV抗体的间接ELISA方法。该方法Cut Off的OD值定为0.5时，敏感性和特异性分别为95.65%和80.43%。因此，选择不同病毒株或者病毒株的不同肽段可能与特异性差异有关。

在我国，杜建[15]表达纯化出EAV N蛋白，并以此蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法，但是由于缺少马EAV标准阳性血清，该方法是在实验动物水平上建立的，并未应用到本体动物。梁成珠等[30]以GP5蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法，该方法的特异性良好。应用该方法和西班牙进口试剂盒INGEZIM-ARTERITIS检测180份血清，结果表明两种检测方法的符合率为95.6%。该方法与病毒中和试验相比，检测900份血清样本的符合率为94.1%。黄素文[20]利用N蛋白建立一种间接ELISA检测EAV抗体，检测557份样品结果与病毒中和试验一致。赵世华[31]用N蛋白作为包被抗原，N蛋白的单克隆抗体作为竞争抗体，建立了竞争ELISA，但是该方法的敏感性较低。ELISA方法作为实验室常用的抗体检测方法之一，敏感性高、特异性强和高通量的特点，适合用于流行病学监测。

2.4 免疫荧光试验

免疫荧光是一种重要的免疫化学技术，通过与荧光标记的特异性抗体结合，可以检测和定位组织和细胞中的多种抗原。根据试验范围和使用的特异性抗体不同，可以分为直接免疫荧光检测和间接免疫荧光检测[32]。Starik E等[33]表达纯化出EAV N蛋白并获得针对该蛋白的单克隆抗体，用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记该抗体，利用此抗体建立直接免疫荧光检测方法，可以用于检测EAV。该方法敏感性高，当进行EAV病毒分离试验CPE未出现或者CPE弱时，可用该方法做进一步诊断。

2.5 荧光微球免疫试验

荧光微球是指在表面或者内部含有荧光物质，受到外界光源刺激能激发出荧光的固相球体。在很多领域发挥重要作用，在生物检测领域尤为广泛。可以应用荧光微球实现对微生物、蛋白、基因和生物小分子的检测[34]。Go Y Y等[35]建立了荧光微球免疫分析方法，利用大肠埃希氏菌表达了全长基因GP5、M和N,以及编码这些蛋白的部分序列GP51-116,GP575-112,GP555-98,M88-162和N1-69。将重组表达的蛋白与荧光聚苯乙烯微球结合，用Luminex xMap 100设备进行分析。在重组表达的这8段序列中，利用GP555-98蛋白建立的方法与病毒中和试验检测的结果一致率最高。应用建立的方法与病毒中和试验进行比较，共检测2 500份样品，敏感性和特异性为92.6%和92.9%。虽然此方法的敏感性低于病毒中和试验，但是其耗费时间短， 对检测人员要求低，适合于资源匮乏的地区使用，对于养殖场的现场快速监测也具有重要意义。

3 总结

马病毒性动脉炎自1953年在美国俄亥俄州首次暴发后，后续有多国报道发生该病。目前中国尚未有地区发生大规模感染，但是由于国际贸易越来越频繁和赛马业的繁荣发展，对EAV的防控越来越重要。在临床应用中，需根据实际情况选择和结合不同的检测方法，才能得到真实可靠的结果。病毒分离鉴定是OIE认定的检测EAV的金标准，但是该方法花费的时间长，不适合对该病的监测，更适合用于成年马发生急性感染和母马流产时进行的检测方法。分子生物学检测方法敏感性高，耗时少，如荧光定量PCR、RT-LAMP、恒温隔绝PCR和套式PCR等各种检测方法，已经得到了普遍的应用。在血清学检测方法中，中和试验是OIE指定的确认方法，但成本高、耗时费力，所以该方法可以作为ELISA初筛后阳性血清抗体的确诊方法。ELISA为最常用的检测方法，适用于大规模监测。目前我国对EAV抗体的检测主要依赖于国外的试剂盒。相信随着对EAV研究的不断深入，新的敏感性高、特异性强、操作简便并且具有我国自主知识产权的检测方法会不断出现，这也是未来研究EAV检测方法的重要方向。