16S rRNA测序技术在动物呼吸道微生物多样性研究的进展

李 娟，郝婷婷，张慧莹，刘 刚，米耀云，李河林，敬晓棋*

(1.榆林学院生命科学学院/榆林市动物疾病诊断与防治重点实验室，陕西榆林 719000；2.清涧县农业综合执法大队，陕西榆林 718399；3.榆林市榆阳区动物疫病预防控制中心，陕西榆林 719000)

呼吸系统疾病对动物健康和畜牧经济效益影响巨大，呼吸道微生物与呼吸道疾病的相关性也逐渐被发现，动物呼吸系统微生物功能机制的研究，已成为对畜禽生产具有重大科学和经济价值的课题。准确了解呼吸系统微生物多样性，对该类疾病的有效预防、合理用药意义重大。常规的实验室培养有很大的局限性，无法完全模拟机体环境，只能对1%～3%的微生物进行培养，不能获取样本中的全部微生物，且培养时间较长、灵敏度较低、特异性差，难以实现对有机体内复杂微生物群落的研究。随着分子生物学技术和高通量测序技术的快速发展，16S rRNA基因测序技术在动物呼吸系统微生物多样性研究中应用越来越多。文中将对16S rRNA扩增子测序技术的概况以及其研究动物呼吸道微生物多样性在不同部位的差异、外界因素对呼吸道微生物多样性的影响方面的应用进行综述。

1 16S rRNA基因扩增子测序概述

在细菌总RNA中16S rRNA占80%以上，16S rRNA基因序列中含9个可变区及10个保守区，保守区是细菌共有部分，反映物种间的亲缘关系；而可变区体现了物种间的差异，差异越大，亲缘关系越远。16S rRNA扩增子测序技术是选择16S rRNA上的可变区，用通用引物扩增样品DNA、高通量测序，再将测序结果与已知16S rRNA数据库进行比对，分析获得样本物种分类及丰度、菌群结构、系统进化等诸多信息。

16S rRNA扩增子测序技术经历了一代测序、二代测序、三代测序三个阶段。一代测序技术主要指1977年Sanger F等[1]提出的DNA双脱氧链终止法和Maxam A M等[2]提出的DNA化学降解测序法。Sanger法(用2,3-双脱氧核苷三磷酸作底物，测定DNA中核苷酸序列)的优势是读长可达1 000 bp，准确性可达99.999%，因测试速度慢、成本高、通量低等不足，没有被大范围的应用。经过不断的优化和改进，在2005年-2008年间，陆续产生了454测序系统、Solexa测序技术以及SOLiD测序技术等二代测序技术，二代测序技术具有通量高、覆盖率高、速度快的优势，但却存在读长短的缺陷，不利于生物信息学分析，且易受GC含量和重复读长的影响。2008年之后出现的He-licos单分子测序仪、SMRT技术和纳米孔单分子测序技术等三代测序技术读长长、运行快、不受GC碱基偏好影响、直接检测表观修饰位点等优点,无PCR扩增环节，避免PCR扩增引入错误，在微生物的分类鉴定和群落多样性的研究中更具有优势。目前，PacBio等三代测序平台对16S rRNA可进行全长测序，序列比对率和鉴定准确率都高于二代测序[3]。

16S rRNA扩增子测序技术最初在无机环境如水、土壤、食品微生物群组研究中应用，现已广泛用于畜禽、水生动物、野生动物及人等机体肠道微生物菌群结构和组成的检测，近年也开始在呼吸道微生物研究中应用。

2 在动物呼吸系统微生物多样性研究中的应用

16S rRNA扩增子测序技术促进了对呼吸道存在的难以培养、低生物量微生物群落的研究，丰富了人们对呼吸道内环境的认识。之前一直认为气管、支气管、肺脏等下呼吸道是无菌的，2010年，Hilty等对肺部进行16S rRNA测序发现了肺脏部位微生物的存在[4]。呼吸道复杂的微生物群组，在维持呼吸道健康、诱导呼吸道疾病的发生中起着重要的作用。通过对呼吸系统微生物多样性的研究，探索其作用的具体机理是最近阶段的热门课题。

2.1 健康动物呼吸道中的微生物多样性在不同空间位点有差异性

呼吸系统各部位的生理结构和理化特征不同，微生物组成也有差异。研究发现，某些致病菌在健康动物上呼吸道的能够正常共生，却也能在全球范围内引起地方性肺炎[5]。因此，了解上、下呼吸道微生物组之间复杂的相互作用，已成为一个对动物健康和养殖回报具有重大科学兴趣的话题。Pirolo M等[6]详细综述了猪上呼吸道和下呼吸道的微生物群落结构，发现上呼吸道的主要为变形菌门和厚壁菌门，与下呼吸道的相对丰度方面存在差异；鼻咽腔和口咽腔微生物在属水平上有显著差异。何川川[7]研究健康与患病绵羊鼻腔、气管上端、气管下端、肺脏几个部位微生物的分布状况，发现健康绵羊呼吸系统4个部位的细菌和真菌在门、属水平上有差异，从鼻腔部位至肺脏微生物物种的丰富度有所降低，但均匀度有所增加。健康绵羊呼吸道内部几乎都有真菌群的存在，但在病羊呼吸道的几个部位中并未检测出真菌。Mcmullen C等[8]详细研究健康牛整个呼吸道17个部位存在的细菌微生物不同部位微生物群落的丰富度和多样性。这些差异是由各种类群驱动的，特别是支原体、链球菌和梭杆菌；肺微生物群与鼻咽部更相似。上呼吸道微生物群落丰富度比下呼吸道高，可能是因为上呼吸道所处环境细菌负荷更高[9]，微生物种类更为丰富。

2.2 健康动物呼吸道中的微生物多样性在不同时间点有差异性

健康动物呼吸道微生物在不同时间也会有所变化。呼吸道微生物在母体分娩过程中、出生后就开始定植，后期因生长活动和外界因素的变化而变化。母猪的阴道和乳头皮肤微生物群是仔猪出生前8 h上呼吸道的重要来源[10]，出生后前7周内鼻腔微生物群的组成和结构发生了显着变化，断奶后2周～3周后趋于稳定[11]。牛鼻咽部细菌的丰度(16S rRNA基因拷贝数)从出生到14 d显著增加，然后略有下降到35 d[12]或保持到 42 d[13]。断奶前犊牛鼻咽微生物群以变形菌门为主，第14天后，显示其微生物的多样性(结合丰富度和均匀度)增加，最丰富的细菌属为曼氏菌、莫拉氏菌、支原体、嗜冷杆菌和假单胞菌。同时这些属的细菌的相对丰度随时间的推移而变化，莫拉氏菌的相对丰度在第14天至第35天之间下降，曼海氏菌和支原体的相对丰度同时大幅增加[12]。Ngunjiri J M等[14]对健康蛋鸡在1、3、5、8、12、16、25、36、51周龄时，呼吸道微生物进行研究，发现年龄对呼吸道微生物细菌β多样性有巨大影响。随着鸡的年龄增长，气管微生物群落组成发生着非常缓慢的变化，在育雏(0周～5周)、生长(6周～16周)和产蛋(17周以后)阶段之间没有明显的差异。鼻微生物群落在育雏和成长阶段逐渐转变，在过渡到产蛋阶段(16周～25周)后变化更为剧烈。

2.3 动物呼吸道微生物多样性受外界因素的影响

呼吸道微生物群落与宿主处于动态平衡状态，维持呼吸道健康。当外界环境改变超过微生物系统调节范围时，这种平衡被破坏，条件致病微生物开始发挥作用，表现出咳嗽、流鼻涕、呼吸困难等临床症状。

2.3.1 环境因素影响 呼吸道传染病的发生往往与周围环境密切相关。环境因子的改变引起宿主免疫力降低，易感性增加，诱发传染病。运用16S rRNA扩增测序技术发现，气态氨浓度、输送、农场管理等环境因素对呼吸道传染病也有影响。

氨气是养殖场主要污染气体之一，气态氨对动物和人类健康有害，浓度高的气态氨对呼吸道刺激强烈，能够抑制呼吸系统的效率。Wang T X等[15]研究了低浓度气态氨暴露期间猪鼻腔微生物群落的动态变化，氨水平升高，会显著损害气管黏膜和肺泡，并降低生长性能；高出一定值会减少乳酸杆菌等有益细菌的定植，增加莫拉氏菌和链球菌的数量。

运输使动物暴露于各种潜在压力之下，带来严重的影响。运输引发的呼吸道疾病，与特定病原体无关，与不同细菌种类的组合有关[16]。之前有研究显示，肉牛[17]和马[18]经过长途运输转移到新环境时，鼻咽微生物群的多样性发生显著变化。Zhao F W等[19]通过16S rRNA测序技术，发现健康驴子经过长途运输后，驴鼻腔微生物群中变形菌门和拟杆菌门的细菌数量增加，厚壁菌门的细菌数量减少，改变了鼻微生物群的丰富性和多样性。

Weese等[20]报道了不同饲喂方式导致猪鼻腔微生物群中巨球菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属和纤维杆菌属等的相对丰度出现显著差异。Nicola等使用IlluminaMiSeq测序平台对来自6个不同农场犊牛呼吸道的微生物群落组成进行了表征和比较，发现不同农场的牛呼吸道微生物群落组成不同。

2.3.2 抗生素影响 在养殖业中抗生素是动物治疗和保健中最常用也是最经济有效的手段。但抗生素的使用与病原菌耐药基因的传播和增多密切相关。已有研究表明，抗生素的活性谱、给药途径、药代动力学和药效学特性不同，对微生物群组成的影响不同；给药途径、持续时间和剂量也会对微生物群组产生不同的影响[21]。抗生素对呼吸道不同部位的影响过程以及潜在的机制仍然是一个主要的研究目标。

Kathy T M等[22]首次发现断奶后仔猪在接受土霉素的饲料添加与肌肉注射两种给药方式时，鼻腔细菌多样性都会下降，对扁桃体微生物群的影响不大。与注射法相比，饲料中添加土霉素对鼻腔微生物群的影响更大，可能与猪采食时鼻腔和饲料中的土霉素接触更多有关。Bond等[23]使用高通量测序研究地塞米松对健康马和轻度哮喘马的上、下呼吸道细菌群落的影响，发现地塞米松对健康马和轻度哮喘马的上呼吸道微生物群的作用效果不明显，但对健康马和轻度哮喘马的下呼吸道微生物群都有影响。地塞米松给药10 d后，健康马和轻度哮喘马的下呼吸道都经历了11个OTU丰度的显着变化，链球菌属等OTU丰度增加，而CandidatusSaccaribacteriaOTU丰度减少，也没有检测到下呼吸道炎症对地塞米松的免疫抑制作用的影响造成的差异。Mohamed Z等[24]研究结晶性头孢噻呋游离酸(CCFA)、硫拉霉素(TUL)、氧环素(OTC)和普卡因西林G(PPG，PPG)5种不同抗生素胃肠外常规剂量给药后，健康生长的猪鼻腔微生物群落组成和多样性在第1、3、7、14天的变化。结果显示，抗生素肠外单剂量给药对猪鼻腔微生物群会产生影响，而这种影响是可变的。在不同的抗菌组之间，不同采样日细菌属相对丰度变化的时间模式不同。这一发现将有助于制定抗生素的替代策略，以改善猪的健康和生产。

2.4 肠道微生物的影响

研究发现，肠道微生物群可通过与肺部微生物群之间的串扰影响肺部健康，这被称为“肠-肺轴”[25],“肠-肺轴”是双向的，即肠道微生物群通过肠道免疫细胞识别共生体和病原体后，释放的微生物产物和免疫调节剂，可以调节肺免疫，影响肺微生物群，反之亦然。微生物群产生的短链脂肪酸、代谢物或细菌素，可能会直接与病毒颗粒相互作用，改变侵染力或治疗效果[26]。在医学上，对新冠肺炎患者的上呼吸道和肠道微生物进行16S rRNA测序，结果显示从感染初期的生态失调到后来多样化的整个过程都在同步变化。这一发现在当时没有针对COVID-19的特定抗病毒药物和疫苗的情况下，对新型冠状病毒防控具有临床意义[27]。肠道和呼吸道微生物群的精确干预和调节可能提供新的治疗选择，益生菌(如双歧杆菌和粪杆菌)、益生元(如低聚木糖)治疗或共生治疗可用于调节肠道和呼吸道微生物群，以促进COVID-19患者的康复[28]。在动物方面，Meera等应用16S rRNA测序技术研究肠道微生物组成对猪肺炎支原体易感性的影响，分析3周龄(断奶)、8周龄(接种猪肺炎支原体之前)和12周龄(接种猪肺炎支原体之后)时，猪肠道中细菌群落的差异和丰度，认为仔猪肠道微生物组的多样性和组成与猪肺炎支原体接种后的发展有潜在关联[29]。肠道微生物群的缺乏增加了鸡感染马立克氏病病毒的严重程度，同时在感染后4 d，肠道菌群衰竭，鸡法氏囊中IFN-α、IFN-β和IFN-γ的转录增加[30]。

3 小结与展望

上面介绍了16S rRNA基因测序的基本概况，归纳了用16S rRNA测序技术评估时空、环境、抗生素、肠道微生物对动物呼吸道微生物多样性的影响。表明不同时空位点、环境条件、抗生素作用及肠道微生物，都会影响动物呼吸道微生物群落的多样性。

16S rRNA测序技术极大的推动了人类探索和研究动物呼吸道微生物多样性的进程，但仍有一些不可回避的局限性，如对样本中物种组成只能分辨到属水平的相对丰度；且结果受样本起始浓度、PCR循环数、扩增引物等诸多因素影响；基于DNA的微生物分析目前无法区分DNA、活细菌和被肺免疫机制杀死的细菌，导致对细菌丰度和多样性的高估等问题。随着分子生物技术的发展、测序平台的改进、信息技术的提升，16S rRNA测序技术将得到不断完善，应用前景更加广阔。在动物呼吸道微生物多样性研究中，16S rRNA区域的选择、测序平台和用于分析的生物信息学工具存在显着差异[6]。试剂盒[31]、采样部位和采样方法也是造成不同实验室结果差异的因素。因此，我们认为，今后关于宏基因组分、试剂盒选择、采样或将趋于标准化，更有利于研究。

人们对动物呼吸道微生物群落的认识还比较有限，相关研究多见于多样性的分析和病原菌的筛选方面，微生物群落与动物呼吸系统疾病之间复杂的相互关系和作用机制，将是今后研究的重点和难点。

研究范围全面系统化。随着微生物组研究的不断发展，越来越明显的是，动物的健康和生产性能在一定程度上受栖息在体内不同的非致病共生体的影响。今后，呼吸道微生物多样性的研究位点的选择将趋于整个系统 、时间选择也将会趋于对整个生命周期、比较的层面也更加全面，从动物整体免疫机能角度研究呼吸道疾病的防治。