m6A RNA甲基化修饰在常见心血管疾病和心肌肥大中的研究进展

2022-11-26杨艺清王爱崔楠张俊哲李昭

中国医科大学学报 2022年1期

杨艺清，王爱，崔楠，张俊哲，李昭

（中国医科大学附属第一医院心血管内科，沈阳 110001）

心血管疾病是多种遗传因素和环境因素之间复杂相互作用的结果［1］，常见的致死性心血管疾病包括缺血性心脏病、高血压性心脏病、心肌病、心力衰竭等。全球卫生政策目标之一是到 2025 年将非传染性疾病导致的早期死亡率降低 25%［1］。因此，研究心血管疾病的机制具有重要的科学和社会学意义。

RNA修饰的类型包括N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）、N1-甲基腺苷、5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶核苷、N6，2’-O-二甲基腺苷［2］和N7-甲基鸟苷［3］等。哺乳动物 mRNA 的最广泛修饰m6A已引起科研工作者的广泛关注。通常m6A 嵌入在5’-RRACU-3’的保守序列中，它主要发生在3’-非编码区的起始段，靠近翻译终止密码子［4］。如今，对m6A修饰与疾病关系的研究越来越广泛和深入，肿瘤领域是热点之一，但关于 m6A 修饰与心血管疾病关系的研究较少。

本文概述了m6A RNA甲基化修饰的关键酶及动态调节过程，重点阐述了m6A RNA甲基化在心血管疾病中的研究进展，讨论了 m6A RNA甲基化新技术，为心血管疾病的预防和治疗提供新的思路。

1 m6A RNA甲基化

m6A修饰的RNA是指RNA分子腺嘌呤的N6甲基化，甲基化过程中存在3种关键酶：甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白。

1.1 甲基化转移酶

甲基化转移酶主要有甲基转移酶样3（methyltransferase-like 3，METTL3）、甲基转移酶样14（methyltransferase-like 14，METTL14）、甲基转移酶样16、Wilms 肿瘤1相关蛋白［5］等成分。

METTL3和 METTL14可以形成稳定的复合物，该复合物可以在体外和体内催化m6A RNA的表观遗传学修饰，Wilms 肿瘤 1 相关蛋白本身没有甲基转移酶活性，但可以与METTL3和METTL14的复合物结合［6］，这三者共同定位于核小点中，在基因表达和选择性剪接的调节过程中发挥重要作用。

1.2 去甲基化酶

去甲基化酶的作用是去除RNA上的m6A修饰，这个过程显示了m6A修饰的动态性和可逆性。去甲基化酶主要包括脂肪肥胖相关蛋白（fat mass and obesity associated protein，FTO）和烷烃化修复同系物5（AlkB homolog 5，ALKBH5），这2个分子是 α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族的一部分［7］。m6A去甲基化可以通过Fe2+和α-酮戊二酸依赖性方式催化。随着FTO和ALKBH5表达的下降，mRNA中的m6A修饰增加。

FTO与人类肥胖有一定关系，被认为是肥胖易感基因，它通过能量消耗和摄入的机制影响体质量指数［8］。FTO催化的m6A去甲基化可以调节mRNA的稳定性、降解和翻译的效率，进而控制蛋白的表达水平。研究［9］表明，FTO是中枢神经系统和心血管系统正常发育必需的酶，证实了α-酮戊二酸依赖的双加氧酶家族的突变会导致严重的多畸形综合征。

富含铁和2-氧戊二酸依赖性核酸加氧酶的AlkB家族有一个名为ALKBH5的成员，研究［10］报道，ALKBH5可催化m6A去甲基化。ALKBH5参与一系列关键的生物过程，如细胞周期、代谢和细胞凋亡。

1.3 甲基化阅读蛋白

m6A甲基化阅读蛋白的主要功能是识别被m6A修饰的碱基，调节RNA的加工、运输、翻译和稳定性［11］。截至目前，已发现的m6A阅读蛋白有YTH家族（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2）［12］、HNRNP家族（HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPG）、IGF2BP家族（IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3）［13］等。

YTH RNA结合蛋白2是第一个特征性m6A阅读器。YTH RNA结合蛋白1最开始与终止密码子附近的m6A位点结合，然后与翻译起始区结合，以提高哺乳动物中特定RNA的翻译效率［14］。YTH RNA结合蛋白3在翻译和稳定性的初始阶段起着至关重要的作用［15］。不均一核糖蛋白家族C参与前体 mRNA加工和选择性剪接，不均一核糖蛋白家族G调节靶mRNA的选择性剪接和丰度［16］。胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白作为m6A阅读器位于细胞质中，优先识别m6A修饰的mRNA，它可以增强mRNA的稳定性并提高翻译效率［17］。

2 m6A RNA甲基化修饰与心肌肥大

心肌细胞可以通过变得肥大来适应血流动力学压力，该反应具有改善心脏功能、减少心室壁张力和氧气消耗的作用。心脏肥大可分为生理性和病理性两种类型。生理性心脏肥大可以维持正常的形态，给心脏带来有益的作用，主要是由于运动训练或怀孕引起的。相反，病理性心脏肥大会带来许多心血管病理生理变化，如心室重构、纤维化和心脏基因表达改变。

HINGER等［18］发现，在人类心力衰竭样本中m6A含量有所增加，但呈保守分布。METTL3的蛋白水平增加，FTO减少，而 ALKBH5水平没有变化。蛋白质印迹法结果显示，CORO6减少，而 RE1沉默转录因子增加。然而，两者的mRNA不受影响。此外，他们检测衰竭的人类心脏和肥厚的心肌细胞中m6A 含量，并发现RE1沉默转录因子增加，而在非衰竭的心脏和正常心肌细胞中观察到CORO6的m6A含量更高。一旦上调 METTL3，RE1沉默转录因子和CORO6的翻译水平就会增加，说明转录后修饰可能直接影响心肌细胞的基因表达，从而导致心肌肥大。

DORN等［19］发现，m6A甲基化程度因肥大刺激而升高。在体外模型中，抑制 METTL3时心肌细胞肥大的生长趋势完全消失，不会发生肥大。然而，过表达METTL3会促进自发性和代偿性肥大。在体内模型中，心脏特异性METTL3敲除小鼠表现出心脏重构和心力衰竭，然后出现心脏稳态失调，而m6A RNA甲基化酶METTL3水平升高，导致心脏肥大。

虽然在上述心肌肥大模型中，部分研究显示METTL3的表达水平变化趋势相反，可能与实验细胞或动物建模方法不同导致肥大的机制不同有关。上述4项研究表明，m6A甲基化酶METTL3对心肌细胞肥大的形成过程有调控作用，m6A去甲基化酶FTO也在心肌肥大的发生、发展中起到重要作用。提示METTL3和FTO可能作为靶点，对病理性心肌肥大具有潜在的治疗和研究价值。

3 m6A RNA甲基化修饰与心血管疾病

3.1 m6A RNA甲基化修饰与心力衰竭

心力衰竭作为一种慢性疾病，在全世界对超过2 000万的患者造成严重影响。BERULAVA等［20］的研究发现，心力衰竭期间m6A RNA甲基化水平降低。具体而言，钙调蛋白1的mRNA水平保持不变，而蛋白表达水平降低。也就是说，m6A RNA甲基化水平影响蛋白水平而非mRNA水平。m6A RNA甲基化与核糖体占据率呈正比，这意味着高甲基化转录本的蛋白水平增加，而低甲基化转录本的蛋白水平降低。FTO 敲除小鼠在主动脉弓缩窄术后心脏表型恶化，表现为射血分数降低和扩张程度增加。

MATHIYALAGAN等［21］发现，去甲基化酶 FTO与心脏的重构和修复有关。他们检测到哺乳动物衰竭的心脏和缺氧心肌细胞中FTO表达水平下降，因此m6A RNA甲基化增加。Sarco/内质网Ca2+-ATP酶2a是一种收缩蛋白，当它高甲基化时，表现出较低的稳定性和调节翻译效率，最终降低心肌细胞的收缩功能。然而，人心肌细胞中 FTO 过表达导致 Sarco/内质网Ca2+-ATP酶2a 去甲基化。随着Sarco/内质网Ca2+-ATP酶2a表达的增加，心脏收缩功能得到改善。他们还发现，在心肌梗死小鼠模型中，FTO 过表达抑制了纤维化并促进了血管生成。这种机制提供了对心脏重构和修复的新见解。

以上2项研究中，诱发心力衰竭的模型存在差别。BERULAVA等［20］使用主动脉弓缩窄术形成压力负荷诱发心力衰竭，MATHIYALAGAN等［21］选择急性心肌组织缺血模型来诱导心力衰竭。但是在心力衰竭模型中，FTO的表达水平均下降，说明了去甲基化酶FTO可能在改善缺血和压力负荷导致的心肌损伤以及修复过程中起作用。

3.2 m6A RNA甲基化与冠状动脉粥样硬化性心脏病

冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。GUO等［22］发现干扰素调节因子-1通过促进m6A修饰，抑制 circ_0029589的表达，从而促进急性冠状动脉综合征和动脉粥样硬化中巨噬细胞焦亡和炎症的新机制。具体而言，急性冠状动脉综合征患者的巨噬细胞中hsa_circ_0029589相对RNA表达水平降低，而hsa_circ_0029589的m6A 水平和m6A甲基转移酶METTL3的表达则显著升高。过表达干扰素调节因子-1抑制了hsa_circ_0029589的表达，但诱导了其m6A水平以及巨噬细胞中 METTL3 的表达。此外，过表达hsa_circ_0029589或抑制METTL3显著增加了hsa_circ_0029589的表达并减弱了巨噬细胞焦亡。这项研究证明了m6A修饰参与并调控了急性冠状动脉综合征和动脉粥样硬化中细胞焦亡的发生过程。

3.3 m6A RNA甲基化与高血压

MO等［23］最近的研究表明，m6A RNA甲基化在血压调节中起至关重要的作用。他们认为，共有1 236个m6A-单核苷酸多态性与血压相关。在这些单核苷酸多态性中，有761个与收缩期血压相关，799个和舒张期血压相关。利用全基因组关联分析2011年和2018年的全基因组关联数据，发现与舒张压相关的单核苷酸多态性的m6A甲基化显著改变。

WU等［24］测定自发性高血压大鼠壁细胞m6A甲基化调控哺乳动物高血压的表观转录组机制。他们采用m6A高通量测序法检测Wistar大鼠细胞和自发性高血压大鼠壁细胞m6A甲基化水平，发现m6A甲基化在mRNA的编码序列区域、3’-非编码区和5’-非编码区更为富集，m6A基序在不同条件下相对保守。自发性高血压大鼠壁细胞m6A的平均丰度整体减少。由此可以得出结论：m6A与哺乳动物高血压有关，可能通过表观转录组机制完成。

3.4 m6A RNA甲基化与心律失常

CARNEVALI等［25］探索了去甲基化酶FTO缺陷小鼠存在心脏自主神经失调和潜在的心律失常现象。小鼠FTO缺乏与生长迟缓、白色脂肪组织丧失、能量代谢增加和全身交感神经激活增强有关［26］。FTO敲除小鼠与野生型小鼠相比，在静息和应激条件下心率值更高，心率变异性增加（低频射频/高频射频比值增加），更容易出现应激诱导的快速心律失常、心室复极改变和心肌肥厚。由此推断，小鼠FTO缺乏导致交感-副交感神经调节失衡，并可能导致心脏电生理性和结构特性的前节律性重塑。然而，交感神经兴奋对心脏本来就有正性变时、正性变力、正性变传导的作用。因此，FTO缺陷的小鼠的心律失常是否仅仅由交感-副交感神经失衡导致仍需要进一步探索。

4 m6A RNA甲基化检测新技术

目前，研究人员正在积极探索在心血管疾病方面m6A修饰相关分子的作用，但仍有许多问题和挑战需要解决，如m6A中使用的广泛转录组地图有助于更好地了解m6A并揭示潜在的表观遗传修饰机制。2012 年，《Nature》和《Cell》发表了一种通过m6A特异性抗体富集对m6A修饰进行全转录组测序的方法［27-28］，但m6A特异性抗体富集的分辨率不足（约100 nt）。近年来，重复性低、样本量大、操作繁琐等原则上无法克服的弱点给m6A研究带来了很大的阻碍。在最新的研究中，ZHANG等［29］引入了一项m6A检测新技术——m6A敏感的RNA核糖核酸内切酶测序，该技术利用新发现的RNA核酸内切酶对m6A有敏感性，摆脱了传统方法对抗体的依赖，实现了对m6A跨转录组的准确检测。随着科学技术的发展，m6A领域的新技术不断涌现。此外，m6A的靶向药物在临床干预心血管疾病方面很有前景。