石榴籽粗提物的提取工艺优化及其对变异链球菌的抑菌作用研究

高 洁， 赵玮钦，李珏丹，程 政

(1.陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室，陕西 西安 710004；2.西安交通大学 口腔医院综合科， 陕西 西安 710004；3.西安科技大学化学与化工学院，陕西 西安 710054； 4.国土资源部煤炭资源勘查与综合利用重点实验室，陕西 西安 710054)

龋病是由附着在牙齿上的特定细菌、唾液等多种因素共同作用下形成的慢性感染类疾病[1]。作为公认的致龋菌，变异链球菌与龋病的发生和发展有着密切的关联。多年来，学者们致力于寻找安全有效的抑制变异链球菌、同时又不破坏口腔正常菌群的防龋药物，如氟化物、氯己定和免疫制剂等，但上述药物因存在副作用、毒性、制作工艺复杂以及生产成本高等缺点，在实际推广应用中均受到一定的限制[2]。研究发现，天然植物提取物具有抑制微生物的作用[3]，一些天然植物提取物可以减少细菌在牙齿表面的黏附，从而达到防龋的目的[4]。石榴是一种常见的天然植物，约50%的质量是由石榴皮和石榴籽组成的，其中，石榴皮提取物不仅对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制作用[5]，还对变异链球菌等口腔病原菌具有抑制作用[6]，但目前对石榴籽提取物的研究相对较少。鉴于此，作者采用超声辅助法提取石榴籽粗提物，对提取工艺条件进行优化，并研究石榴籽粗提物对变异链球菌的抑制作用,为天然植物提取物用于龋病防治研究提供理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

石榴籽,陕西临潼；变异链球菌UA159，空军军医大学口腔医院；脑心浸液肉汤(BHI)，青岛海博生物科技有限公司。

正己烷、无水乙醇,天津富宇精细化工有限公司；乙酸乙酯,广东光华科技股份有限公司；硫酸亚铁、氯化钠,郑州派尼化学试剂厂；水杨酸，天津天力化学试剂有限公司；30%过氧化氢，天津河东区红岩试剂厂；0.9%氯化钠注射液(生理盐水)，山东齐都药业有限公司；琼脂粉、酵母浸粉、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；氨苄青霉素，北京博奥拓达科技有限公司。

高速多功能粉碎机，永康铂欧五金制品有限公司；全温振荡培养箱，太仓豪城实验仪器制造有限公司；循环水式多用真空泵，金坛金祥龙电子有限公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；单人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；超低温冷冻储存箱，中美美菱低温科技股份有限公司；数显恒温水浴锅，无锡远路贸易有限公司；电子天平，福州华志科学仪器有限公司。

1.2 石榴籽粗提物的提取

1.2.1 石榴籽的预处理

将石榴籽用蒸馏水洗净，置于70 ℃恒温鼓风干燥箱中干燥，用高速多功能粉碎机粉碎，过40目筛，置于干燥的锥形瓶中密封保存，备用。

1.2.2 提取方法的选择

超声波辅助提取法：称取5.0 g石榴籽粉末于250 mL锥形瓶中，按料液比1∶20(g∶mL，下同)加入100 mL无水乙醇，瓶口用棉塞塞紧，在30 ℃、超声波功率100 W下超声提取30 min；抽滤，用旋转蒸发器除去溶剂；置于70 ℃恒温鼓风干燥箱中干燥，得粉末状粗提物，称重，按下式计算石榴籽粗提物得率：

式中：m1为烧杯和石榴籽粗提物的质量，g;m2为烧杯的质量，g;m为石榴籽粉末的质量，g。

浸提法：称取5.0 g石榴籽粉末于250 mL锥形瓶中，按料液比1∶20加入100 mL无水乙醇，瓶口用棉塞塞紧，充分混匀后，在30 ℃全温振荡培养箱中振荡30 min，取出置于棕色瓶避光静置18 h；抽滤，用旋转蒸发器除去溶剂；置于70 ℃恒温鼓风干燥箱中干燥，得粉末状粗提物，称重，计算石榴籽粗提物得率。

1.2.3 提取工艺的优化

采用单因素实验优化石榴籽粗提物的提取工艺，考察提取溶剂(无水乙醇、正己烷、乙酸乙酯)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，g∶mL)、提取时间(30 min、60 min、90 min、120 min)、提取温度(35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃)、超声波功率(10 W、40 W、70 W、100 W)对石榴籽粗提物得率的影响。

1.3 石榴籽粗提物的抑菌活性

1.3.1 菌悬液的制备

变异链球菌UA159冻干株在厌氧培养箱中37 ℃静置培养(10%CO2、10%H2、80%N2)复苏48 h，革兰氏染色镜检菌落生长形态，确认无污染后，将单个菌落接种到BHI培养基中，37 ℃厌氧培养24 h，采用紫外可见分光光度计将菌液浓度调至OD600=0.1，备用。将5 mL生理盐水注入灭菌的150 mL锥形瓶中，再用灭菌的接种环刮取少量健康单菌落置于锥形瓶中，打散、摇匀，制成菌悬液。

1.3.2 菌体培养基的制备

BHI培养基的制备:称取3.7 g BHI、1.8 g琼脂，加入150 mL蒸馏水加热溶解，高压、121 ℃灭菌15 min，冷却至约50 ℃，加入1 mL氯化血红素、维生素K1溶液。

将上述BHI培养基从灭菌锅中取出，往每个无菌培养皿中趁热倒入约20 mL，静置，冷却凝固。将约50 ℃、45 mL的BHI培养基倒入菌悬液中，充分混合均匀，用移液枪移取约6 mL(含200 μL 变异链球菌UA159菌液)于每个培养皿中(将表面覆盖均匀即可)，制成菌体培养基。

1.3.3 石榴籽提取液的制备

将石榴籽粗提物用蒸馏水配制成120 mg·mL-1的母液，按二倍稀释法溶于菌体培养基中，然后稀释成5个浓度梯度(30 mg·mL-1、15 mg·mL-1、7.5 mg·mL-1、3.75 mg·mL-1、1.875 mg·mL-1)的石榴籽提取液，121 ℃灭菌20 min。用含1 μg·mL-1氨苄青霉素的BHI培养基作为阳性对照，不含石榴籽提取液的BHI培养基作为空白对照。

1.3.4 抑菌圈直径的测定

采用牛津杯法测定抑菌圈直径。在超净工作台上，各组试液各0.2 mL吸入牛津杯中，轻轻放入菌体培养基中，牛津杯放置一定要平稳到位，以确保牛津杯内物质均匀扩散，每个培养皿中均匀放置3～4个牛津杯。将培养皿置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，测定抑菌圈直径，每组测定3次，结果取平均值。

1.3.5 最低抑菌浓度(MIC)的测定

取200 μL变异链球菌UA159菌液接种于BHI培养基上，37 ℃下于厌氧盒中培养24 h，观察菌落生长。在深色背景下，肉眼观察无细菌生长，即试管内液体清亮无混浊或沉淀的最低药物浓度为最低抑菌浓度。平行测定3次，结果取平均值。

1.3.6 统计学分析

2 结果与讨论

2.1 石榴籽粗提物的工艺优化

与浸提法相比，超声波辅助提取法的石榴籽粗提物得率较高、所耗时间较短。因此，选用超声波辅助提取法进行后续实验。

2.1.1 提取溶剂对石榴籽粗提物得率的影响(表1)

表1 提取溶剂对石榴籽粗提物得率的影响Tab.1 Effect of extraction solvent on yield of crude extract from pomegranate seeds

由表1可知，以无水乙醇为提取溶剂时，石榴籽粗提物得率最高；以正己烷和乙酸乙酯为提取溶剂时，石榴籽粗提物得率相差不大。因此，选择无水乙醇为提取溶剂。

2.1.2 料液比对石榴籽粗提物得率的影响(图1)

注：无水乙醇为提取溶剂，提取时间40 min，提取温度30 ℃，超声波功率100 W图1 料液比对石榴籽粗提物得率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on yield of crude extract from pomegranate seeds

由图1可知，当料液比从1∶10减小到1∶20时，石榴籽粗提物得率上升较快，从37.6%提高到41.2%；但当料液比从1∶20减小到1∶25时，石榴籽粗提物得率下降到40.9%，呈缓慢下降趋势。因此，选择料液比为1∶20。

2.1.3 提取时间对石榴籽粗提物得率的影响(图2)

注：无水乙醇为提取溶剂，料液比1∶20，提取温度30 ℃，超声波功率100 W图2 提取时间对石榴籽粗提物得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on yield of crude extract from pomegranate seeds

由图2可知，当提取时间从30 min延长到90 min时，石榴籽粗提物得率上升较快，从39.2%提高到42.2%；但当提取时间继续延长到120 min时，石榴籽粗提物得率下降到42.0%，呈缓慢下降趋势。因此，选择提取时间为90 min。

2.1.4 提取温度对石榴籽粗提物得率的影响(图3)

注：无水乙醇为提取溶剂，料液比1∶20，提取时间90 min，超声波功率100 W图3 提取温度对石榴籽粗提物得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of crude extract from pomegranate seeds

由图3可知，当提取温度从35 ℃升高到45 ℃时，石榴籽粗提物得率从41.2%提高到44.6%，呈明显上升趋势；但当提取温度继续升高到65 ℃时，石榴籽粗提物得率下降到43.6%，呈缓慢下降趋势。因此，选择提取温度为45 ℃。

2.1.5 超声波功率对石榴籽粗提物得率的影响(图4)

注：无水乙醇为提取溶剂，料液比1∶20，提取时间90 min，提取温度45 ℃图4 超声波功率对石榴籽粗提物得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on yield of crude extract from pomegranate seeds

由图4可知，当超声波功率从10 W提高到40 W时，石榴籽粗提物得率从35.0%缓慢提高到36.2%；当超声波功率继续提高到100 W时，石榴籽粗提物得率提高到44.6%，呈快速上升趋势。因此，选择超声波功率为100 W。

2.2 石榴籽粗提物的抑菌活性(图5)

由图5可知，30 mg·mL-1、15 mg·mL-1、7.5 mg·mL-1石榴籽粗提物组抑菌圈直径分别为(13.0±1.4) mm、(11.0±1.2) mm、(10.0±2.1) mm；加入1 μg·mL-1氨苄青霉素的阳性对照组抑菌圈直径为(21.0±2.1) mm；3.75 mg·mL-1、1.875 mg·mL-1石榴籽粗提物组、空白对照组均未见抑菌圈形成。与空白对照组相比，高浓度石榴籽粗提物组和各氨苄青霉素组均有极明显的抑菌圈(P<0.01)，其中30 mg·L-1石榴籽粗提物组具有明显的抑菌作用。石榴籽粗提物对变异链球菌UA159的最低抑菌浓度为7.5 mg·mL-1。

1～5:石榴籽粗提物浓度(mg·mL-1)分别为30、15、7.5、3.75、1.8751a～5a:1～5中加入1 μg·mL-1氨苄青霉素图5 石榴籽粗提物的抑菌活性实验结果Fig.5 Experimental results of antibacterial activity of crude extract from pomegranate seeds

2.3 讨论

有效抑制致龋菌的生长一直是龋病防治研究的重点，天然植物因具有来源丰富、抑菌作用良好且毒副作用小等优势逐渐成为研究热点。石榴作为常见的天然植物，获取便利，富含鞣质类、黄酮类、生物碱及有机酸类化合物[7]，其中，酚类和黄酮类化合物具有抗菌、抗炎和抗氧化特性[8-10]，可降低氧化应激，抑制脂质过氧化和泡沫细胞生成，减少巨噬细胞的脂质摄取[11]。本课题组前期研究发现，石榴皮中原花青素可以抑制变异链球菌生物膜的形成，并对其相关毒力基因的表达也有抑制作用。

3 结论

以石榴籽为原料，采用超声辅助法提取石榴籽粗提物，确定最优提取工艺条件为：以无水乙醇为提取溶剂、料液比1∶20(g∶mL)、提取时间90 min、提取温度45 ℃、超声波功率100 W，在此条件下，石榴籽粗提物得率为44.6%。石榴籽粗提物对变异链球菌UA159具有抑制作用，推测可能与石榴籽粗提物中多酚等活性成分有关，但其具体的作用机制仍需要进一步研究和探讨。