脱细胞技术在气管组织工程构建中的应用展望

王尧，钱军 综述孙云浩，季明明，朱敏，许建宁 审校

南京大学医学院附属盐城第一医院(盐城市第一人民医院)胸心外科，江苏盐城 224005

气管切除并端端吻合是当前气管重建的金标准，但仅限于病变气管段不超过成人总气管长度的1/2或小儿的1/3[1-4]。当病变气管超过最大限度时，进行气管重建有一定难度，因为气管不仅仅是一个简单的圆柱状通气管道，而是由复杂的多层结构组成[5]。气管是由15～20个“C”形软骨构成，在气管内表面覆有纤毛上皮，外表面含有平滑肌、血管等结缔组织。气管软骨维持着气管圆柱状形态，防止气管塌陷；而气管内表面呼吸上皮中的纤毛对气管的清洁有着重要作用；气管软骨周围的结缔组织则保证了气管的曲伸及收缩、扩张等机械运动[6-7]。因此，还没有办法完全重建这样复杂的多层结构以及完全模拟其功能。目前在气管组织工程构建中常用技术是脱细胞与3D打印技术，本文主要对脱细胞技术在组织工程气管中的研究进展进行综述。

1 脱细胞技术

通过化学和生物酶、物理或组合方法去除组织/器官内的细胞成分，有效地保留组织/器官的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)及三维结构，同时诱导并促进细胞的增殖、分化、黏附，最终重建或修复组织/器官原本的功能[8-9]。

2 脱细胞方法

2.1 化学方法该方法原理为利用去污剂、酸碱溶液等化学试剂处理组织/器官，通过溶解细胞膜和解离细胞内部结构，同时完整保留细胞外基质，从而达到脱细胞的目的[10]。理想的化学脱细胞试剂应具有毒性低、清除细胞效率高及最大程度保留基质生物力学特性等优点。Triton X-100、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulphate，SDS)与脱氧胆酸钠(deoxycholate，SD)是脱细胞过程中最常用的脱细胞试剂[11]。SDS是最广泛使用的离子型去污剂，它通过溶解细胞膜和核膜起作用，能完全去除细胞及消除至少90%的宿主DNA。但SDS在脱细胞同时使基质血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)含量减少，弹性模量减低，且SDS具有细胞毒性，组织脱细胞后需要进行反复的清洗后才能接种细胞[12-13]。SD是另一种离子型去污剂，通过溶解细胞膜起作用，与SDS相比，SD不会破坏基质结构且毒性低，但会导致DNA凝集在组织表面[14]。Triton X-100是一种非离子型去污剂，可以通过其分子上的亲水基团溶解细胞而达到清除血管壁细胞成分的目的。相比SDS，Triton X-100对组织结构完整性的损害及细胞毒性较小，但清除细胞能力欠佳[15]。三种常用化学脱细胞试剂都有各自不足，须与物理方法及酶等方法联合使用才能达到理想的脱细胞效果。

2.2生物方法该方法原理为用胰蛋白酶、核酸酶等来处理组织/器官，清除细胞DNA及细胞外基质中的某些成分来达到脱细胞效果[16]。酶处理时间过长或浓度过高，可显著改变基质结构，破坏层黏连蛋白并去除GAG，严重损害基质的生物力学性能[17]。因此，为了制备优质的脱细胞基质，酶常与化学脱细胞试剂联合使用。ZHANG等[18]联合使用胰蛋白酶、SDS、Triton X-100对猪腹直肌进行脱细胞处理后发现细胞和DNA被充分去除，层黏连蛋白、Ⅳ型胶原和纤连蛋白得以完整保留。同时，脱细胞肌肉显示出与天然肌肉相似的机械强度，超微结构、脉管系统和神经通道也完好无损。同样，先用Triton X-100及SD对人肺进行脱细胞处理后再用脱氧核糖核酸酶处理，结果发现残留DNA被完全清除，从而避免了体内潜在的免疫反应[19]。

2.3 物理方法该方法原理为借助超声波、冻融、高压与超临界二氧化碳等方法来脱细胞，通过溶解细胞和破坏细胞基质黏附蛋白来达到消除细胞的目的。冻融法是最常用的物理方法，其通过冷冻组织，形成细胞内结晶，破坏细胞膜，导致细胞溶解。但该方法必须控制温度变化速率，控制形成冰晶的大小，防止对ECM的过度损伤[20-21]。高压法是通过对组织施加压力来达到溶解细胞的目的，但这种方法只对ECM致密的组织或器官有效(如肝和肺)[22]。超声波法是运用超声波在液体中的空化作用以及强烈的振动与搅拌作用将细胞击碎[23-24]。但是，目前尚未研究出破坏细胞时超声波的最佳幅度和频率。超临界二氧化碳法是一种有前景的方法，由于超临界二氧化碳具有类液体的密度和类气体的扩散率，其临界温度为31.1℃，临界压力为7.40 MPa，与生物系统兼容[25-26]。该方法优点在于二氧化碳不会留在组织内，因此不需要大量清洗。然而，二氧化碳是非极性的，需要加入极性夹带剂(如乙醇)来去除细胞的极性磷脂膜，从而清除细胞核和膜。所有的物理方法优点在于可以避免化学试剂或酶的毒性，减少对ECM的损害，但缺点在于需要反复清洗才能去除残留的细胞碎片及DNA，避免免疫排斥反应。因此，物理方法需要结合化学或生物方法才能进一步提高脱细胞效率。

3 脱细胞技术在气管组织工程构建中的应用

脱细胞气管基质不仅具有无免疫原性、无毒性、良好的生物相容性，同时还保留原生气管的三维结构和细胞外基质，是长段气管缺损修复的理想支架材料。

3.1 脱细胞技术在动物实验中的应用杨文龙等[27]利用去污剂联合酶法制备脱细胞气管支架，随后与京尼平交联后进行动物体内移植实验。研究结果显示移植后15 d未出现严重的免疫排斥及炎症反应，效果与自体气管移植无明显差异。但长时间移植后脱细胞气管支架的稳定性及生物相容性有待进一步研究。王志豪等[28]采用两个周期的改良去污剂联合酶法制备的兔脱细胞气管基质，生物力学性能较原生气管仅轻微下降，组织学结果显示上皮及黏膜层细胞被完全去除，免疫原性下降。改良的去污剂联合酶法虽然缩短了脱细胞周期，节约成本，但未进行动物体内实验，移植效果尚不确定。蒋媛等[29]采用2%TritonX-100联合脱氧核糖核酸酶Ⅰ和核糖核酸酶对兔气管进行脱细胞处理，组织学分析表明黏膜上皮细胞成分基本被去除，软骨细胞少量残留；扫描电镜结果显示气管内表面无细胞残留，基底膜光滑，有轻微破坏。同样，ZHANG等[30]分别使用1%、2%、3%、4%TritonX-100和核酸酶对兔气管进行脱细胞处理，组织学与扫描电镜结果显示经2%TritonX-100和核酸酶处理的气管纤毛上皮细胞完全消失，软骨细胞大量保留，基底膜完整。异体皮下埋植实验证实了脱细胞气管基质无免疫原性，具有良好的生物相容性。细胞共培养实验表明脱细胞气管基质提供的微环境有利于细胞增殖。因此，2%TritonX-100处理制备的脱细胞气管基质具有良好的力学性能和生物相容性，可帮助气管损伤的修复重建。KAJBAFZADEH等[31]将十二烷基硫酸钠制备的脱细胞气管植入裸鼠体内，利用其自身作为天然生物反应器，结果证实了脱细胞气管基质的组织结构得以保留，并具有良好的生物力学性能。移植后3个月、6个月和12个月获取的活检样品中软骨成分和结缔组织中的细胞播种程度均较高。AOKI等[32]提出了一种使用双室生物反应器使气管移植物去上皮化并随后用外源细胞重新填充移植物的新颖方法。他们首先用十二烷基硫酸钠通过内室灌注3 h可有效去除大部分气管上皮细胞，同时经生长培养基灌注的外室可使大部分软骨细胞存活，最后使气管移植物重新上皮化。这项研究将脱细胞技术与生物反应器结合制备气管移植物，既保留了移植物的结构和机械性能，同时保持了软骨的活力，并实现了细胞附着和再填充。上述研究都为进一步原位气管移植提供了一些基础，但仍需要长期的实验研究，将来才有望应用于临床。GIRALDO-GOMEZ等[33]使用胰蛋白酶法对长段猪气管进行脱细胞处理，HE染色与DNA残留含量定量分析表明气管腔内无细胞成分及DAN含量明显减少；抗原性消失；扫描电镜显示胶原纤维在软骨周围组织中保留下来；生物力学结果证实脱细胞气管基质与正常气管两者的机械性能无显著性差异；细胞跟踪和活力分析显示软骨细胞在接种8 d后依然保持软骨细胞特征形态及活力。该研究表明胰蛋白酶制备的脱细胞气管基质可作为气管替代物，但体内移植效果需要进一步的实验研究来验证。OHNA等[34]利用高静水压技术对猪气管进行脱细胞处理后进行体内移植，术后6个月和12个月研究发现气管腔被脱细胞气管补片修复，周围有再生软骨，部分均匀地结合到脱细胞气管补片中，诱导了气管重构。但是过高的压力会导致蛋白质变性，影响脱细胞气管基质的生物力学性能，因此，选择合适的压力至关重要。LANGE等[35]通过将真空脱细胞法制备的脱细胞猪气管，与正常气压下制备的脱细胞猪气管进行对比，结果显示：与对照组相比，真空脱细胞法制备的脱细胞气管完全清除纤毛上皮细胞和软骨细胞，残留的DNA少，胶原蛋白、糖胺聚糖含量及生物力学性能无明显差异。随后，他们将用真空脱细胞法制备的脱细胞人气管埋植到大鼠体内14 d，研究发现气管支架均保持良好的形态，未出现免疫排斥反应等不良反应。BULTER等[36]将通过真空脱细胞法制备的脱细胞人气管与去污剂联合酶法所制的脱细胞人气管进行比较，研究发现两者脱细胞效果相似，鸡绒毛尿囊膜和皮下植入实验证实了脱细胞气管基质不仅促进血管向内生长，同时具有较好的生物相容性。真空脱细胞法制备周期短(约9 d)，成本相对较低，但在负压影响下组织结构会发生膨胀，且细胞黏附情况、糖胺聚糖丢失影响、原位移植效果仍需要通过实验来进一步研究，最终形成真空脱细胞法的标准程序以便将来应用在临床上解决气管替代物缺乏的难题。

3.2 脱细胞技术在临床中的应用MACCHIARINI等[37]2008年在《柳叶刀》杂志上报道了首例由去污剂联合酶法制备的脱细胞气管移植病例。患者因肺结核浸润导致左主支气管塌陷引起严重的呼吸困难，他们将人供体气管通过去污剂联合酶法进行25个周期的脱细胞处理后，去除了细胞、HLA和MHC抗原并保留细胞外基质，同时将患者自身上皮细胞与间充质干细胞来源的软骨细胞种植到脱细胞气管内表面，最后进行左主支气管重建。术后第4天细胞学分析表明腔内有大量上皮细胞，纤毛中见到软骨细胞。术后4个月随访显示：患者恢复可，未服用免疫抑制药物，可进行正常生活，肺功能检测在正常范围内，CT提示气管通畅、无塌陷。该案例虽然取得了成功，但组织工程气管的血供及如何在气管内外表面均匀且高效种植细胞等问题仍需要进一步研究。GONFIOTTI等[38]报道了该患者5年随访结果显示：患者正常生活，肺功能检测在正常范围内，未出现免疫排斥反应及癌变等情况。1年后支气管镜检查发现吻合口处出现进行性瘢痕狭窄，需要反复进行腔内支架置入术。然而，组织工程化气管仍保持开放，血管化良好，呼吸道上皮细胞重新形成，纤毛功能和黏液清除功能正常。因此，通过去污剂联合酶法制备的人脱细胞气管与自体上皮细胞和干细胞共培养后用于长段气管病变的修复重建是可行的，但由于制备周期长，且移植后基质机械性能下降容易导致狭窄、塌陷等并发症，未能在临床上广泛推广和应用。ELLIOTT等[39]报道了一例12岁患儿因长段先天性气管狭窄进行气管移植的病例。术前他们将骨髓间充质干细胞种植到脱细胞气管上，随后移植到患儿体内。术后予以注射转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)促进软骨生成及人类重组促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)促进血管生成。术后1周脱细胞气管已重新血管化，1年后细胞学检查提示气管腔已上皮化，18个月后部胸部CT扫描和通气-灌注扫描均正常。在随访的2年中，患者呼吸功能正常，已正常生活。之后研究者们陆续报道了儿童脱细胞气管移植案例，但儿童脱细胞气管移植的难点在于移植物需要适应生长的需要及如何快速的血管化。因此，对所有年龄段的儿童进行气管移植，移植物生长的实验证据收集对临床至关重要。

4 展望

组织工程学是一门结合工程学、材料学和生命科学相结合的的交叉学科，用于替代、修复或改善人体组织器官的形态和功能[40]。组织工程气管旨在替换或再生人体气管组织，以恢复长段气管损伤患者正常的呼吸功能。组织工程气管三个关键因素包括细胞外基质、细胞和生物反应器，其中细胞外基质是气管功能重建的基础。利用脱细胞技术制备的脱细胞气管基质已得到广泛认可，不仅可以保留细胞外基质、去抗原性、具有良好的生物相容性和力学性能，且可支持种植细胞的黏附、增殖、分化，最终实现组织功能修复和结构重塑。但目前脱细胞技术研究主要停留在动物实验阶段，应用于临床上仍需进一步的研究，气管脱细胞过程中仍有许多问题亟待解决[9]，譬如：如何缩短脱细胞周期和降低成本；如何更好地清除细胞成分和维持基质稳定性和完整性；如何更好地促进种植细胞的黏附和生长；如何更好地将生物方法、化学方法与物理方法三者结合使用进一步提高脱细胞效率。目前有将脱细胞气管支架与其他气管支架联合使用用于气管移植。TAN等[41]将猪脱细胞真皮基质与镍钛合金支架构建成复合气管支架，用于替代治疗1例晚期肺癌侵犯左主支气管的患者。术后患者恢复良好，支气管镜检查及活检结果显示术后4个月复合气管支架完全血运重建和再上皮化，未发生与气管替代物植入的相关并发症。

相信随着组织工程气管及脱细胞技术的进一步发展，其可以不断改善气管基质的缺陷，优化气管基质的性能，同时与其他气管基质结合使用，构建出安全、高效的气管基质，为解决临床上长段气管替代物缺乏提供有效的途径，减轻患者的痛苦，提高生活质量。