水产品中孔雀石绿残留量测定前处理方法研究与优化

○蒋翠红 杨翼羽 于林海 郭贵良

（长春市水产品质量安全检测中心 吉林长春 130000）

孔雀石绿是水产养殖中禁用的一种三苯甲烷类染料，因其对治疗鱼的水霉病具有特效且价格低廉，加之宣传力度不够等原因，使得不少养殖户还在小范围使用。近年来研究发现，孔雀石绿在生物体内有明显蓄积现象，会导致水生生物脊椎、头和背鳍等部位畸变，卵染色体发生异常，对哺乳动物具有高毒、高残留、致癌、致畸和致突变等副作用，残留时间达100天以上，食用含孔雀石绿的水产品，会对人体健康产生危害，因此准确测定水产品中孔雀石绿具有重要意义。目前，国内检测部门通用的方法是GB/T 20361-2006高效液相色谱荧光检测器法，但该法前处理繁琐、耗时，溶液转移次数多，易造成损失。本文参考GB/T 20361-2006法，根据实际检测工作，探讨并优化了提取、萃取等影响检测的环节，建立一种前处理简便、快捷，回收率稳定的水产品中孔雀石绿残留量的检测方法。

1 试验材料及设备

1.1 试验材料

（1）乙腈为色谱纯；二氯甲烷、硼氢化钾溶液、酸性氧化铝和乙酸铵等为分析纯；水为超纯水。Agilent酸性氧化铝固相萃取柱（500mg，3mL）；Agilent PRS固相萃取柱（500mg，3mL）；孔雀石绿标准品（98.0%±0.2%）购置于德国Dr公司。

（2）精确称取孔雀石绿标准品0.0100g，用乙腈定容到100.00mL，配制成100μg/mL的标准溶液，-18℃避光保存。使用前稀释成需要浓度。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200高效液相色谱（配荧光检测器FLD），离心机，漩涡振荡器，旋转蒸发仪，固相萃取装置，超声萃取仪，组织搅碎机。

2 试验方法

2.1 样品处理

将水产品用清水淋洗干净。鱼去鳞、去皮，沿背脊取肌肉部分；虾去头、壳、肠腺，取肌肉部分；蟹、甲鱼等取可食部分。样品切为不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混合，搅碎混匀，四分法取样。所取样品分为2份，一份供测定，另一份放置于-20℃冰箱中保存，备用。

2.2 提取

①称取5.00g样品于50mL离心管内，加入10mL乙腈，加入5g酸性氧化铝，振荡2分钟，超声波5分钟，4000r/分钟离心10分钟，上清液转移至125mL分液漏斗中，在分液漏斗中加入2mL二甘醇，3mL0.2mol/L硼氢化钾溶液，振摇2分钟。②在离心管中加入10mL乙腈，3mL0.2mol/L硼氢化钾溶液，用玻棒捣散离心管中的沉淀并搅匀，漩涡混匀器上振荡1分钟，静置20分钟，4000r/分钟离心10分钟，上清液并入125mL分液漏斗中。③在离心管中继续加入1.5mL盐酸羟胺溶液、2.5mL对-甲苯磺酸溶液、5.0mL乙酸铵缓冲溶液，振荡2分钟，再加入10mL乙腈，继续振荡2分钟，4000r/分钟离心10分钟，上清液并入125mL分液漏斗中。

在分液漏斗中加入25mL二氯甲烷，具塞，剧烈振摇2分钟，静置分层，将下层溶液转移至250mL鸡心瓶中，继续在分液漏斗中加入5mL乙腈、15mL二氯甲烷，振摇2分钟，静置分层，将下层溶液合并至250mL鸡心瓶，45℃旋转蒸发至近干，用2.5mL乙腈溶解残渣。

2.3 净化

将PRS柱安装在固相萃取装置上，上端连接酸性氧化铝固相萃取柱，用5mL乙腈活化，转移提取液到柱上，再用乙腈洗鸡心瓶两次，每次2.5mL，依次过柱，弃去酸性氧化铝柱，吹PRS柱近干，在不抽真空的情况下，加入3mL等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液（pH=10），收集洗脱液，乙腈定容至3mL，供液相色谱测定。

2.4 测定

2.4.1 高效液相色谱条件 色谱柱为Agilent ODS-C18柱（内径250mm×4.6mm，粒度5μm）；流动相为乙腈-乙酸铵溶液（80∶20）；流速1.3mL/分钟；柱温35℃；激发波长265nm；发射波长360nm；进样量20μL。

2.4.2 色谱分析 将配好的孔雀石绿标准工作溶液及样品提取液置于液相色谱仪的样品盘中，按上述色谱条件进行色谱分析，记录峰面积，响应值均应在仪器检测的线性范围之内。根据标准品的保留时间定性（图1），外标法定量（图2）。

图1 10 ng/mL孔雀石绿标准溶液液相色谱图

图2 标准曲线

3 结果与讨论

3.1 样品提取优化

（1）GB/T 20361-2006法中提取只采用匀浆机以10000r/分钟的速度均质30s，匀浆只可以打碎一部分细胞，提取不完全。而本方法则采用组织搅碎机搅碎结合超声破碎的方法提取样品，同时省去了GB/T 20361-2006法中另取离心管加乙腈洗涤匀浆机刀头的步骤，防止了用匀浆机匀浆增加加标损失，影响回收率。隐色孔雀石绿是孔雀石绿在生物体中的代谢产物，存在于细胞内，超声提取弥补了匀浆机的不足，进一步进行细胞破壁提取，使组织内成分提取更加完全，有利于目标物的溶出，提高回收率。此外，超声时间需要控制，时间过长容易引入较多的杂质，时间过短会造成提取不完全。有研究表明，超声提取以5分钟为宜。

（2）GB/T 20361-2006方法的样品前处理过程中，样品要经历4次采用乙腈提取结合4次离心获得目标物提取液，提取步骤多，成本高，影响回收率。为此，本方法省去第4步用乙腈提取并离心的步骤，这与2016年农业部组织的水产品中孔雀石绿残留检测能力验证作业指导书中要求的相一致，减少了提取步骤，降低了成本，提高了工作效率。

3.2 样品液液萃取优化

在实际样品前处理过程中，水相与有机相的比例影响二者的分层效果，比例不当会导致两相倒置、两层界面模糊、乳化等现象。GB/T 20361-2006法采用液相法，用二氯甲烷进行反萃取时，第一次加入20mL二氯甲烷，第二次加入10mL二氯甲烷，由于乙腈对水的溶解度较大，分层不明显，萃取效率低下，且容易使二氯甲烷发生倒相的现象，同时，有研究表明，试验中水相的存在有助于去除样品中水溶性杂质，因此水相的比例也不能过低。对此，本方法增加了二氯甲烷的用量，第一次加入25mL，第二次加入15mL，以使二氯甲烷相处于下层，避免了倒相，并且第二次萃取不用离心，仍用分液漏斗，分层效果也很明显，既缩短了分离时间，又提高了提取效率。

3.3 样品过滤膜改进

由于市面上的滤膜质量参差不齐，有时出现一些滤膜的杂峰，干扰出峰，使得谱图不美观，所以本方法将过柱提取液直接于刻度管中定容上机测定，节约了成本，提高了效率。

本方法目标峰能与其它杂质峰完全分离，峰形较好。

4 小结

本方法在GB/T 20361-2006法的基础上进行了改进，将样品前处理的匀浆提取改为样品涡动和离心，且经超声提取，提高了目标物的溶出效果，减少了匀浆带来的损失，提高了回收率，同时，省去了第4步用乙腈提取并离心，减少了提取步骤，降低了成本；在萃取步骤增加了二氯甲烷用量，且第二次萃取不用离心，防止了倒相，缩短了分离时间，又提高了提取效率；实验最后不用过滤膜过滤直接上机进行测定，节省了消耗品的成本，也避免了杂峰的干扰。需特别注意的是在样品前处理的过程中，应避免强光直射。结果表明，经改进的方法用于检测水产品中孔雀石绿残留量简便、快捷，出峰时间缩短，提高了工作效率，适用于日常水产品中孔雀石绿残留量检测工作的需要。当然，在今后的工作中笔者会继续对水产品中孔雀石绿残留量测定的前处理方法进行进一步研究、不断改进，使之更加完善。