磷酸二酯酶通过cAMP-PKA 途径调控核盘菌菌核原基的形成

吕蕊花，陈 萌，赵 倩，冯 昭，史琳娜，张喜荣

（陕西中医药大学 医学技术学院，陕西 咸阳 712046）

核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）菌核是菌丝在生长中遇到有限的营养环境，进行复杂的生理结合相互缠绕形成的坚硬结构，菌核在核盘菌侵染循环中起核心作用，可萌发产生子囊孢子，子囊孢子作为侵染源可以通过气流传播到寄主的根、茎、叶等器官而引起发病。植物一旦感染菌核病将很难得到控制，发病率也会逐年升高，甚至绝收，严重影响现代农业生产的发展[1]。因此，揭示核盘菌菌核形成机制，对于防控该病害的发生以及靶向杀菌剂的开发具有重要的理论和实践意义。

核盘菌菌核形成同时受外界环境条件的诱导和内部信号分子的调节。光照、pH 值、碳源、活性氧、生物群落等因素[2⁃3]通过调节细胞内信号转导途径来调控菌核的生长发育过程，核盘菌菌核发育主要受环磷酸腺苷依赖的蛋白激酶（Cyclic adenosine monophosphate⁃dependent protein kinase A，cAMPPKA）信号通路调控。1998 年，ROLLINS 等[4]以菜豆中分离出来的S.sclerotiorum为研究对象，发现培养基 中 腺 苷-3′，5′-环 磷 酸（Adenosine 3′，5′cyclic monophosphate，cAMP）添加量为5 mmol/L 便可抑制菌核的形成；同样地，在不能形成菌核的灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）突变菌株中，cAMP 含量也明显上升[5⁃6]，表明cAMP 是抑制菌核形成的一个重要因素。磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDEs）作为细胞内水解cAMP 的酶类，与丝状真菌的很多生命活动密切相关[7⁃8]。柑橘褐斑病菌（Alternaria alternatatangerine pathotype）的低亲和性磷酸二酯酶基因（Low⁃affinity cAMP phosphodiesterase，Pdel）缺失会使病原菌分生孢子的产孢量以及黑色素沉着减少，并且Pdel在胞内cAMP水平的调控中发挥着重要作用[9]。黄曲霉（Aspergillus flavus）PDEs 缺失突变株（ΔpdeH）产生的分生孢子和菌核数目均明显减少[10]。阿托品（Atropine）作为毒蕈碱受体抑制剂，可以抑制PDEs 水解cAMP，从而增加细胞内cAMP水平[11]。

PDEs是一个多基因大家族，其成员在不同真菌中的功能不尽相同，PDEs 家族具体如何调控cAMP水平而影响核盘菌菌核形成，目前尚未见报道。鉴于此，分析PDEs 在cAMP-PKA 途径中对核盘菌菌核生长发育的调控过程，明确该通路系统调控菌核形成的机制，为核盘菌靶向杀菌剂的开发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

菌株：核盘菌（菌株编号：CCTCC AF 2021085Sclerotinia sclerotiorumSs10715）前期分离自油菜秸秆并保存于陕西中医药大学生物技术教学实验中心。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，由去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉12 g、蒸馏水1 000 mL制成。

试剂：PCR 扩增、检测及产物克隆所用试剂盒均购自TaKaRa 公司，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自OMEGA 公司，琼脂糖、核酸Marker、预染EB 均购自生工生物工程（上海）有限公司，RNA 提取试剂盒、反转录及定量PCR 所用试剂盒均购自TaKaRa公司，cAMP、阿托品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

仪器：定量PCR 仪器购自Applied Biosystems 公司，光学显微镜购自日本Olympus 公司，双压电泳仪和电泳槽购自北京君意公司。

1.2 PDEs对核盘菌生长发育的影响检测

配制PDA 培养基并分装，高压灭菌后于无菌条件下分别加入cAMP和阿托品至终浓度为2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L 和8 mmol/L，将核盘菌菌丝块接种于含不同浓度cAMP 和阿托品的培养基上，每个浓度重复5 次，于25 ℃光照培养箱中培养，以不添加cAMP和阿托品的PDA培养基上接种的核盘菌菌丝作为对照（CK），统计核盘菌菌丝生长速率以及菌核形成情况。菌丝生长速率=测量的菌落直径/接种天数。

1.3 核盘菌PDEs的克隆与表达分析

收集PDA 培养基上不同生长时期（菌丝生长期、菌丝形成菌丝团、菌丝团产生黑色素、成熟菌核）的核盘菌，按照TaKaRa公司RNA 提取试剂盒说明书提取总RNA，1.5%琼脂糖凝胶检测RNA 提取质量并用微量紫外分光光度计测定浓度。以提取的总RNA 为模板，将其反转录为cDNA，以EF引物（表1）检测cDNA的质量，检测合格后以此为模板进行后面试验。

从核盘菌基因组数据库中共检索得到8 个PDEs基因序列，采用同源克隆的方法进行扩增。以反转录得到的cDNA 为模板进行PCR 扩增，引物见表1，将回收的PCR 产物与pMD18-T simple vector连接并转化E. coliDH5α 感受态细胞，挑选PCR 鉴定为阳性的菌株送生工生物工程（上海）有限公司进行测序，并对测序结果进行分析。根据测序获得的8 个PDEs 序列进行qRT-PCR 引物（表1）在线设计（https：//www.genscript.com/tools/real⁃time⁃pcr⁃taqman⁃primer⁃design⁃tool），以β-tubulin作为内参，每组试验重复3次，应用2-△△Ct进行数据分析。

1.4 PDEs对cAMP-PKA通路的调控分析

为了进一步探究核盘菌菌核原基形成时cAMP-PKA通路中AC（F：5′-ACCGGATCTGGAAA⁃GTGAAG-3′，R: 5′-GGCATGTTCCACAATCTCAC-3′）、PDE1（F：5′-AGCATGGTATCCGACCGATT-3′,R: 5′-CTCCTGTACATCCAGCTCGT-3′）、PDE2（F:5′-TCTACCGGAGCATTCCCATC-3′，R：5′-AGCGA⁃AGCAGGGAAGTAAGA-3′）、PKA（F：5′-CGTTCGG⁃TTCTTGCAGATGT-3′，R：5′-CTCGTCGAATCGTTT⁃GGCTT-3′）和RAS（F:5′-AGGGCGAGAGACAAGTT⁃TCA-3′，R：5′-TAGCACCACCAGCTGTGTAA-3′）的表达量，分别收集在含1、2、3、4 mmol/L 阿托品的PDA 培养基上生长8 d（菌核原基形成时）的菌丝，提取其RNA，并检测浓度，将合格样品反转录为cDNA，以此为模板进行qRT-PCR，每组试验重复3次，应用2-△△Ct进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 PDEs对核盘菌生长发育的影响

在PDA 培养基上添加PDEs 特异性抑制剂阿托品对核盘菌菌丝生长具有抑制作用。当添加阿托品浓度为2 mmol/L 时，对菌丝生长速率影响很小，但当阿托品浓度为4 mmol/L 时，菌丝生长缓慢，抑制率可达80%以上，阿托品浓度大于6 mmol/L 时菌丝不生长，而菌丝可在cAMP 浓度为8 mmol/L 的培养基上生长（图1A、1C）。表明PDEs 在核盘菌菌丝生长发育过程中具有重要作用。除此之外，添加阿托品的培养基对菌核产生的数目也有影响，当阿托品浓度为1～3 mmol/L 时，培养基上均可产生菌核，浓度越高菌核产生的数目越多。其中，当添加阿托品浓度为3 mmol/L 时，每皿（8 cm 直径）平均可产生47 个菌核，而对照每皿产菌核的数目平均为21 个（图1D）。当添加的阿托品浓度为4 mmol/L时，形成的菌丝较疏松，不能形成菌核（图1B），表明PDEs不仅影响核盘菌菌丝发育，而且在菌核形成过程中也具有重要作用。

图1 PDEs对核盘菌菌丝生长和菌核形成的影响Fig.1 Effects of PDEs on mycelial growth and sclerotia formation of Sclerotinia sclerotiorum

2.2 核盘菌PDEs的克隆与表达

采用同源克隆的方法从核盘菌中共扩增到8个PDEs 基因片段（图2），测序后比对分析发现，8 个PDEs序列与目的片段同源性在99%以上。由qRTPCR 分 析 结 果 发 现，XM_001587616（PDE1）和XM_001588027（PDE2）在菌丝形成菌核的4 个阶段表达量均较高，其中，这2 个基因在S1 阶段表达量最高，而其他6 个基因表达量在这4 个阶段均较弱（图3）。将PDE1和PDE2提交NCBI，得到基因登录号分别为MZ611861和MZ611862。

图2 扩增的PDEs琼脂糖凝胶电泳结果Fig.2 Determination of amplified PDEs gene through agarose gel electrophoresis

图3 菌丝形成菌核不同阶段PDEs的相对表达量Fig.3 Relative expression levels of PDEs in different stages of sclerotia formation

2.3 PDEs对cAMP-PKA通路的调控

收集在不同浓度阿托品培养基上生长8 d 的核盘菌菌丝为材料，检测PDEs 对菌核原基形成的影响。由检测结果可知，当培养基中添加阿托品浓度为1～4 mmol/L 时，cAMP-PKA 通路中相关基因表达趋势相同，PDEs 上游基因AC和RAS表达量上调，PDE1、PDE2和PKA表达量均下降，但PDEs 抑制剂对PKA表达量的抑制作用并非呈典型的浓度对应关系（图4）。表明PDEs 与菌核原基的形成密切相关，PDEs 抑制剂通过抑制PDE1/2的表达使得下游因子PKA表达量下降，进一步影响菌核原基的形成。

图4 cAMP-PKA途径相关因子表达量Fig.4 Expression levels of cAMP-PKA pathway related factors

3 结论与讨论

菌核在核盘菌侵染循环中起核心作用，阻止菌核形成是切断传染源最有效的策略。现阶段，农业生产上预防菌核病发生的最有效措施还是喷洒杀菌剂，主要包括苯并咪唑类和二甲酰亚胺类，但长期使用这几类杀菌剂会造成抗药性和交叉抗性[12]，因此，新型靶向杀菌剂的开发显得尤为重要。

本研究从菌核形成的重要途径cAMP-PKA 出发，以该通路中发挥调控作用的PDEs 为着手点，从8 个PDEs 中筛选出2 个表达量较高的PDE1/2作为研究重心。研究发现，当在培养基中添加阿托品时，cAMP-PKA 通路中PDEs 上游基因AC和RAS表达量上调，PDE1、PDE2和下游因子PKA表达量均下降。腺苷酸环化酶（Adenylate cyclase，AC）作为cAMP 的上游作用因子，其缺失菌株可以产生更多的小分生孢子且致病性缺失，最终形成畸形的菌核[13]。蛋白激酶A（PKA）作为cAMP-PKA 途径的下游效应物，既可以调控病原菌的生长水平，同时对菌株毒力和致病力也发挥着重要调控作用。例如敲除尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）中的FoCPKA和粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）中的PKAC-1，均可导致其生长水平和产孢能力下降[14⁃15]。在S.sclerotiorum中，PKA 活性水平在由菌丝生长发育为白色菌核时最高，而在不产生菌核的突变株中PKA的表达水平则很低[16]，由此可知，cAMP-PKA 通路中AC 和PKA 对菌核形成非常重要。本研究在添加了PDEs 抑制剂后检测出的AC表达量上调，而PKA表达量较低，说明PDEs 抑制剂通过抑制PDE1/2的表达使得下游因子PKA表达量下降，进一步影响菌核原基的形成，本研究结果可为开发以PDEs 为靶标的杀菌剂提供理论基础。