藤本月季“安吉拉”花芽分化形态结构及内源激素变化研究

刘智媛 曾 丽 杜习武 彭勇政 陶懿伟 李雨清 秦 俊

（1. 上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2. 上海辰山植物园，上海 201602；3. 上海城市树木生态应用工程技术研究中心，上海 200020）

藤本月季“安吉拉”（Rosa cv.‘Angela’）为多年生蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（Rosa）植物，因其观赏性及抗性强广泛应用于城市园林绿化中，是优良的城市垂直绿化植物材料［1］。狭义的花芽分化指的是植物从营养生长转向生殖生长，进而发育成花器官原基雏形的过程［2～3］，而广义的花芽分化则将其分为生理分化阶段、形态分化阶段和性细胞分化成熟阶段3 个阶段［4］。植物的花芽分化过程受到内部及外部环境的影响，主要包括基因调控、营养物质、内源激素及外界环境等因素［5］。内源激素与花的生长发育密切相关，在植物花芽分化过程中起到重要作用，也是前人研究花芽分化的主要途径之一。前人在植物花芽分化及内源激素动态变化研究较多，主要集中在梨、桃、柑橘、葡萄、杏、荔枝等果树方面的研究［6］；有关蔷薇科蔷薇属植物的相关研究，主要对小姊妹月季花、玫瑰、单叶蔷薇及月季“芬得拉”的花芽分化的形态结构进行了初步研究［7～10］，但有关藤本月季“安吉拉”花芽分化及内源激素的相关研究尚未见报道。

本研究以藤本月季“安吉拉”为试验材料，通过石蜡切片和体视显微镜观察花芽分化不同阶段形态结构，同时通过联酶免疫法测定其内源激素，研究花芽分化过程的形态结构及内源激素的变化，为调控藤本月季“安吉拉”开花数量、开花质量和开花时间提供理论数据，为藤本月季在园林景观中进一步发展和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

藤本月季“安吉拉”，来自上海辰山植物园，进行常规养护管理。

1.2 试验方法

1.2.1花芽分化形态结构观察

体视显微镜观察：从2019 年3 月20 日开始每5 d采取藤本月季“安吉拉”新梢顶芽，随机取20个新梢顶芽，利用镊子剥去其外部幼叶，放于Olym⁃pus SZX16 体视显微镜下进行解剖观察，对其花芽分化不同时期进行拍照记录。

石蜡切片法观察：新生枝条中选择10～20 个新梢顶芽放于FAA 溶液中固定24 h，进行脱水，透明，浸蜡，包埋，修块等步骤后，用莱卡Leica2245切片机进行切片，切片厚度为8～10 μm，切片后放置于莱卡H1220 烘片台烘片，至条带完全展开后，用苏木精/伊红溶液进行染色，置于Olmypus BX41生物显微镜下观察并拍照记录。

1.2.2联酶免疫法测定内源激素

采集不同花发育时期新梢顶芽，首先在体视显微镜下观察判断不同花芽分化时期，再分别将不同花芽分化时期的花芽放入冰盒中，用液氮速冻，置于-80℃冰箱中。分别称取不同花芽分化时期的去除幼叶的顶芽0.1 g，加1 mL 样品提取液（磷酸缓冲溶液，pH7.4），2 000～3 000 r·min-1离心20 min，收集上清液于4℃冰箱待测。

试剂盒及试验方法由上海酶联生物公司提供，用纯化的植物内源激素捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，向包被的微孔中分别加入不同花芽分化时期的待测液10 μL，加入稀释液40 μL。随后加入辣根过氧化物（HRP）酶标记的检测抗体100 μL，形成抗体—抗原—酶标抗体复合物，置37℃烘箱中培育60 min。经过彻底洗涤后加3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）底物A 液和B 液各50 μL 显色，37℃避光显色15 min。加入显色剂HRP 酶50 μL 转化成黄色后用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过绘制标准曲线计算待测样品内源激素含量（ng·g-1FW）。

1.3 数据分析

采用SPSS22.0 进行数据分析，使用SigmaPlot 14.0软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 藤本月季“安吉拉”花芽分化过程

采用体视显微镜和石蜡切片观察藤本月季“安吉拉”花芽分化的过程（见表1，图1～2）可分为5个时期，共历时30 d。2019年3月20日仍处于形态分化期（Ⅰ），5 d 后开始进入萼片原基分化期（Ⅱ），在生长锥边缘开始出现萼片原基分化，随后分别进入花瓣原基分化期（Ⅲ）和雄蕊原基分化期（Ⅳ），花瓣原基与雄蕊原基几乎同时围绕生长锥进行轮状分化，最后进入雌蕊原基分化期（Ⅴ），扁平的生长锥顶端突起分化出多个雌蕊原基，2019年4 月20 日左右完成花器官原基雏形成过程。不同花芽分化时期形态特征如下：

形态分化期：3 月中下旬，通过石蜡切片在显微镜下观察发现幼叶包裹的圆锥状突起结构（见图2A），即为生长锥，此时叶芽和花芽从外观结构上无明显差别。在体视显微镜下解剖该时期新梢顶芽，也可见明显绿色的凸起（见图1A）。

表1 藤本月季“安吉拉”花芽分化进程Table 1 Process flower bud differentiation in Rosa‘An‐gela’

萼片原基分化期：为3月底至4月初，生长锥变扁平，并于生长锥周围产生5个小突起，为萼片原基（见图1B～C，图2B），不同萼片原基形成时期及大小不一致，分化完成后5个萼片原基大小基本一致。

花瓣原基分化期：为4月上旬，已分化出的5个萼片原基不断向上伸长变宽，同时萼片原基内方开始出现花瓣原基的突起（见图1D，图2C），且突起数目不断增多，以轮状形式排列（见图1E，图2D）。

雄蕊原基分化期：为4月上、中旬，花瓣原基内侧开始产生突起（见图1F，图2E）即为雄蕊原基，萼片原基和花瓣原基不断伸长，雄蕊原基数目增多（见图1G），在外轮雄蕊原基的下方继续分化成数轮雄蕊原基（见图1H）。

雌蕊原基分化期：为4 月下旬，雌蕊原基分化较雄蕊分化时期晚，雄蕊原基大量分化后，雄蕊原基顶部分化形成花药，中下部分化成为花丝，生长锥顶端继续变宽平，其上开始产生多个突起（见图1I～J，图2F），即雌蕊原基开始分化，随后生长锥向下凹陷，花托边缘向上伸长，雌蕊原基位于花托中，且彼此分离（见图2G），完成了花器官原基雏形的分化。

随花发育雄蕊原基逐渐伸长（见图1J），花丝着生于花托边缘，形成具多个雄蕊的雄蕊群。雌蕊原基顶端也逐渐分化成柱头，中部延长形成花柱，基部膨胀为子房，形成多个彼此分离的雌蕊群，着生于瓶装花托中（见图2H）。

2.2 花芽分化过程内源激素的变化

由图3可看出，花芽分化过程中脱落酸（ABA）浓度总体呈先上升后下降的趋势，萼片原基分化期ABA 浓度最高，为25.41 ng·g-1FW，但与花瓣原基分化期和雄蕊原基分化期无显著差异；雌蕊原基分化期ABA 浓度最低，为19.77 ng·g-1FW，且显著低于其他时期。

赤霉素（GA）浓度随花芽分化呈逐渐下降的趋势，形态分化期GA 浓度最高，为12.28 ng·g-1FW。萼片原基分化期、花瓣原基分化期和雄蕊原基分化期GA 浓度无显著差异。雌蕊分化期时GA浓度最低，为9.20 ng·g-1FW，显著低于其他时期。

细胞分裂素（CTK）浓度变化与ABA 相似，总体呈先上升后下降的趋势，萼片原基分化期CTK浓度最高，为15.04 ng·g-1FW，与花瓣原基分化期以及雄蕊原基分化期无显著差异。CTK 浓度在雌蕊原基分化期达到最低，为12.70 ng·g-1FW，显著低于其他分化时期。

生长素（IAA）浓度变化呈逐渐上升趋势，形态分化期最低，为660.74 ng·g-1FW；萼片原基分化期、花瓣原基分化期和雄蕊原基分化期IAA浓度逐渐升高，但彼此无显著差异；雌蕊原基分化期IAA浓度最高，为964.18 ng·g-1FW，显著高于其他分化时期。

2.3 激素平衡与花芽分化的关系

图4 可看出，CTK/GA 形态分化期时比值最低，为1.01，萼片原基分化期时比值显著升高，与形态分化期差异显著，与花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期无显著性差异，雌蕊原基分化期时比值最高，为1.65，显著高于其他分化时期。

IAA/GA 比值呈逐渐上升的趋势，在形态分化期最低，为54.03，显著低于雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期。在雌蕊原基分化期时显著增高，且高于其他时期，比值为106.24。

IAA/ABA 的比值总体呈逐渐上升的趋势，在萼片原基分化期最低，但与形态分化期、花瓣原基分化期和雄蕊原基分化期无显著性差异。在雌蕊原基分化期时显著增高，且高于其他时期，比值分别49.23。

（CTK+ABA）/GA 比值在形态分化前期时最低，为2.84，萼片原基分化期时比值显著升高，与形态分化期差异显著，与花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期无显著性差异，雄蕊原基分化期时比值最高，为3.83。

3 讨论

3.1 月季花芽分化形态结构研究

前人研究发现月季的花芽分化呈螺旋状，即先萼片，再花瓣、其次是雄蕊，最后是雌蕊的顺序，且花瓣几乎与最初的雄蕊同时开始分化［8，11］。本研究发现藤本月季“安吉拉”花芽各部分分化顺序由外向内进行，花芽分化分为5 个时期，生长锥呈圆锥状突起为形态分化期；生长锥逐渐变宽圆，在生长锥周围出现5个萼片原基分化期；萼片原基内方分化出花瓣原基，即为花瓣原基分化期；花瓣原基内方分化出多个雄蕊原基，为雄蕊原基分化期；生长锥继续变宽，从扁平的生长锥顶端形成多个突起为雌蕊原基，即为雌蕊原基分化期，花芽分化过程历时30 d，藤本月季“安吉拉”花芽分化顺序与前人研究结果一致。关于月季花芽分化过程的分期研究，马子俊根据花芽的形态变化，将苦水玫瑰分化过程分为3 个阶段［8］；王瑞勤等认为玫瑰的花芽分化开始于混合芽完成营养生长阶段之后，并将玫瑰的分化过程分为8个时期［12］；贺海洋等利用石蜡切片方法将单叶蔷薇的花芽形态划分为6个时期，分别为形态分化前、苞叶原基分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期［7］。胡祖坤通过石蜡切片观察，将小姊妹月季花芽分化时期详细分为了16 个时期［10］；Maas等通过扫描电镜和光学显微镜研究Ro⁃sa‘Mercedes’的花芽分化时期，将其分为9 个时期［13］；范天刚等将月季‘芬得拉”花芽分化进程划分为5 个阶段，分别为萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期和分化完成期［9］，本研究结果与范天刚研究结果相似。

3.2 花芽分化过程内源激素含量变化

ABA 可加快有机物在地上部分的积累及植物的分化速度，有利于花芽分化［14］。本研究发现萼片原基分化时期ABA 含量达最高，显著高于形态分化期，到雌蕊原基分化期其含量则为最低，显著低于雄蕊原基分化期及花瓣原基分化期，与前人研究相似，说明ABA 对藤本月季“安吉拉”的花芽分化具促进作用。

CTK 能促进花芽形态分化，较高的CTK 水平能促进细胞分裂，打破生长锥的顶端优势，解除腋芽的抑制，促进生长锥的分化［15～16］。本研究中CTK变化与ABA 变化相似，萼片原基分化时期含量最高，显著高于形态分化期，雌蕊原基分化期其含量显著低于雄蕊原基分化期及花瓣原基分化期，与前人研究相似，说明较高的CTK 含量有利于藤本月季“安吉拉”的花芽分化。

GA 有效抑制RNA 合成，抑制成花基因的表达，从而减缓植物花芽分化进程［17］。本文研究结果表明GA 在藤本月季“安吉拉”形态分化期含量最高，显著高于其他分化时期，随花芽分化进程GA 不断下降，雌蕊原基分化期其含量最低，GA 含量的降低有利于藤本月季“安吉拉”花芽的分化。

IAA 的相关研究一直存在争议，樊卫国等认为较低IAA含量有利于刺梨的花芽分化［18］，而Costanti⁃ni，E通过基因转入手段证实IAA促进葡萄品种“汤姆逊无核”的花序形成［19］。本研究发现IAA的浓度在形态分化期时显著低于其他时期，随后IAA含量逐渐上升，并在雌蕊原基分化达到最高，说明较低IAA浓度有利于藤本月季“安吉拉”的花芽分化。

3.3 内源激素平衡与花芽分化的关系

Nooden 等认为激素保持一定的平衡状态才能有效调控植物的生长发育以及花芽分化［20］。目前，越来越多的学者把关注点放在激素平衡与花芽分化关系中，提出了CTK/GA、IAA/ABA、（ZR+ABA）/GA、IAA/GA 等激素之间的平衡关系，花序诱导中需要较低的IAA/GA 比值，较高的IAA/ZR含量有利于花序形成，ZR/GA 和（ZR＋ABA）/GA比值上升，可促进植物花芽分化进程［21～22］。本研究结果显示，CTK/GA 和（ABA+CTK）/GA 比值在形态分化期时最低，萼片原基分化期显著高于形态分化期，说明萼片原基分化期CTK/GA 和（ABA+CTK）/GA 比值升高与花芽分化诱导有关，使植物由营养生长向生殖生长转变，进入花芽分化阶段；IAA/GA 和IAA/ABA 比值在形态分化期最低，随花芽分化进程逐渐升高，在雌蕊原基分化期增加显著，且高于其他时期，说明IAA/ABA 和IAA/ABA的升高可促进花器官原基的进一步发育，这与前人研究结果相似。

4 结论

本文通过体视显微镜及石蜡切片法将藤本月季“安吉拉”花芽分化过程共分为5 个时期，历时30 d，分别为形态分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期。不同花芽分化时期内源激素的测定结果表明，ABA、CTK 浓度在萼片原基分化期显著升高与花芽分化诱导有关，较低的IAA 浓度以及GA 浓度的降低有利于藤本月季“安吉拉”的花芽分化；萼片原基分化期CTK/GA 和（ABA+CTK）/GA 比值升高与花芽分化诱导有关，高水平的IAA/ABA 和IAA/GA比值与花器官原基的进一步发育相关。

月季花芽分化是一个十分复杂的过程，环境变化、基因调控、营养物质积累、外源激素的施用均会影响月季花芽分化，但具体的调控机制及相关影响因子还有待进一步研究。