8 种观赏草对铜锌复合胁迫的生理响应及耐受性评价

许志敏，周 英，杨鹏辉，熊志秦，吴一非，姜珺珺，丁国昌

（1. 江西科技学院 艺术设计学院，江西 南昌 360100；2. 福建农林大学 园林学院，福建 福州 350002；3. 九江市野生动植物保护中心，江西 九江 332000）

随着城镇化和工业化的快速发展，以及人类日常活动强度的加大，大量重金属污染物排放入自然系统，进而降低自然资源质量，危害所有形式的活生物体正常生长生存[1⁃2]。土壤是重要的物质和能量交换媒介，亦是陆生植物生长繁殖的物质基础，人为的干扰是导致土壤污染加剧的主要原因[3]。全球年均释放到环境中的锌为23.6万t，铜为14.7万t，而我国土壤中的铜、锌污染亦占较大比例[4]，因此治理土壤重金属污染已成全球性难题。同时，土壤重金属污染大多数是2 种或2 种以上重金属共同作用而形成的复合污染[5]，拮抗、协同和加和作用加大了对土壤重金属污染的治理难度。相较于其他土壤治理技术，植物修复技术具有操作简便、净化率高、成本低且可大面积推广应用等特性[6]，而开展高效修复能力的植物种类或个体筛选及机制研究是建立植物修复技术的关键环节[7]。

观赏草作为一类株型优美、色彩丰富、种类多样的新型园林绿化植材[8]，具有较高的观赏及生态价值，被广泛应用于城市公园、专题园、生态园区等各类园林绿地。目前，观赏草的研究主要集中于种质 资 源 搜 集[9⁃10]、生 理 生 化[11⁃12]及 园 林 应 用[13⁃14]等 领域，而观赏草具备生物量大、根系庞大、生长迅速、抗逆性强等特性，符合超富集植物或耐性植物的筛选条件，作为潜在植物修复技术应用植材的研究报道较少。鉴于此，在孟晓蕊[15]、何新杰等[16]研究的基础上，初步筛选8种观赏草作为供试材料，设置不同梯度的铜锌复合胁迫试验，从生长指标及抗氧化酶方面探究其生长及生理响应，然后利用Pearson相关性分析和隶属函数法进行耐受性综合评析，旨在揭示8种观赏草对铜锌胁迫环境的耐受性、适应性，以期为铜锌超富集植物的种质资源筛选及观赏草耐重金属机制研究提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为1 年生小兔子狼尾草、金红羽狼尾草、紫叶狼尾草、细叶芒、丽色画眉草、细叶画眉草、香茅、粉黛乱子草，采购于福州乐彩园艺责任有限公司。选择个体、分蘖和健康状况基本一致的1 年生实生苗，在福建农林大学中华植物园大棚中进行试验。

1.2 试验方法

土壤铜、锌复合胁迫处理设置5个浓度梯度，梯度值如表1 所示，每个处理重复3 次。选用福州本地的红壤土作为盆栽基质，土壤风干过筛，铜以CuSO4·5H2O、锌以ZnSO4·7H2O 水溶液的形式加入土壤中并混合均匀，在室温下静置30 d后装盆，每盆[28 cm（径）×35 cm（高）]装土4 kg（干质量），盆下垫托盘。盆栽土铜、锌质量浓度分别为11.37、68.63 mg/L。2019 年4 月初进行植株移栽换盆，并将植株修剪至同一高度，4 月中旬对供试材料进行土壤铜锌复合污染处理。自处理后，根据每盆土壤水分状况，每隔1～3 d 等量浇入自然水一次，使土壤的田间持水量保持在80%左右。为了避免重金属的流失，每次加完水后清洗托盘，再将水倒入盆中。

表1 盆栽试验铜锌复合胁迫处理梯度值Tab.1 Copper-zinc combined stress gradient values in pot test mg/L

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长状况测定

1.3.1.1 生长状态观察 在铜锌复合胁迫90 d（2019 年7 月中旬），对植株铜锌复合胁迫伤害症状采用分级调查法[17]进行调查，将植株胁迫伤害症状分为5 级。0 级：正常生长，表现特征看不到伤害症状；1级：叶色微黄，轻度伤害；2级：中心部位及外围不同程度失绿；3 级：植株矮小、萎蔫，叶片失绿；4级：叶片萎蔫失绿，严重时脱落，死亡。

1.3.1.2 株高和根长测定 在铜锌复合胁迫90 d（2019 年7 月中旬），测定植株株高、根长。用钢卷尺自植株的地径至最长叶尖测量株高，用直尺自根部至根尖测定根长。

1.3.2 生理活性指标测定 在铜锌复合胁迫90 d（2019 年7 月中旬），参考王学奎[17]的方法测定植株叶片中丙二醛（MDA）含量、过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性4项指标。使用多功能酶标仪测定各指标的吸光度值。

1.3.3 耐铜锌胁迫能力评价 采用模糊数学中隶属函数值的方法进行抗逆性综合评定[18]。隶属函数值的换算方法：

式中，R(Xij)表示i处理j指标的耐铜锌隶属函数值，Xij表示i处理j指标的测定值，Xjmax和Xjmin分别表示各处理的最大和最小测定值，R(Xi)为i处理的耐铜锌隶属函数值的平均值，n为指标数。

1.4 数据处理

所有数据处理和统计分析均基于Excel 2010和SPSS 23.0 软件进行，采用Excel 2010 软件作图。运用One-Way ANOVA 进行方差分析，有显著或极显著差异时用DUNCAN’S法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 铜锌复合胁迫对供试观赏草生长状态的影响

如表2 所示，随着胁迫浓度的升高，8 种观赏草受胁迫伤害程度加剧。在T1 时，金红羽狼尾草、紫叶狼尾草和细叶画眉草胁迫伤害等级为0 级，生长势正常；其余5 种观赏草的胁迫伤害等级为1～2 级，出现不同程度的叶色发黄、失绿、叶缘卷边的症状，均属于轻度损伤。在T2 时，除细叶画眉草外，其余7 种观赏草均受到不同程度的胁迫伤害，其中细叶芒、丽色画眉草和粉黛乱子草的胁迫伤害等级达到3级，供试植株矮小、萎蔫，叶片失绿，均属于中重度损伤。在T3—T4 时，除细叶画眉草外，其余7 种观赏草的胁迫伤害等级最高达到4 级，供试植株的叶片萎蔫失绿，部分叶片严重脱落，根部出现腐烂症状，甚至死亡。

表2 铜锌复合胁迫伤害症状分级调查结果Tab.2 Investigation on classification of injury symptoms under Cu2+and Zn2+combined stress 级

2.2 铜锌复合胁迫对供试观赏草株高、根长的影响

如表3 所示，不同处理对供试观赏草株高及根长的影响有所差异。金红羽狼尾草和粉黛乱子草的株高随铜、锌质量浓度的升高呈先增后减的趋势，其余6种供试观赏草的株高呈逐渐降低的趋势。在T1时，金红羽狼尾草和粉黛乱子草的株高较对照分别显著高出10.40%、7.94%（P<0.05）；而小兔子狼尾草的株高下降幅度最大，仅为对照的64.81%。在T2—T4 时，8 种供试观赏草株高的下降速率加快，T4时株高均降至最低。

表3 铜锌复合胁迫对供试观赏草株高、根长的影响Tab.3 Effects of Cu2+and Zn2+combined stress on plant height and root length of tested ornamental grasses cm

金红羽狼尾草、紫叶狼尾草和细叶画眉草的根长呈先增后减的趋势，其余5 种供试观赏草的根长均呈逐渐下降的趋势。在T1 时，金红羽狼尾草、紫叶狼尾草和细叶画眉草的根长分别较对照增加了5.98%、3.35%、3.38%；其他5 种供试观赏草的根长出现不同程度的下降，细叶芒、香茅和粉黛乱子草根长显著低于对照（P<0.05），表明低浓度胁迫对其根系的生长造成了明显的抑制作用。在T2—T4时，8 种供试观赏草的根系生长受到的抑制作用随铜、锌质量浓度的升高而加剧，在T4 时根长降至最低，这种影响效应与株高保持一致。

2.3 铜锌复合胁迫对供试观赏草MDA含量的影响

如图1可知，8种供试植物的MDA含量随铜、锌质量浓度的升高逐渐增加并高于对照，且不同品种间存在较大差异。紫叶狼尾草的MDA 含量受胁迫影响最大，在T1 时，其MDA 含量达到1.17 µmol/g，是对照的1.61 倍；在T2—T3 处理时，MDA 含量分别是对照的2.64 倍、3.63 倍，且均与对照差异显著（P<0.05）；T4 则均死亡，未获取到样本。在T1 时，金红羽狼尾草和丽色画眉草的MDA 含量分别为1.19、1.36µmol/g，与对照无显著差异（P>0.05），随着质量浓度的持续增加，二者MDA含量分别较对照增加了1.46～2.43 倍、1.49～2.64 倍。小兔子狼尾草、细叶芒和粉黛乱子草在各个处理间变化趋势相近，在T4时MDA 含量达到最高，三者MDA 含量分别为对照的3.08 倍、2.99 倍和3.32 倍。香茅的MDA 含量变化较小，T1—T4是对照的1.20～2.19倍。

图1 铜锌复合胁迫对供试观赏草MDA含量的影响Fig.1 Effects of Cu2+and Zn2+combined stress on MDA content of tested ornamental grasses

2.4 铜锌复合胁迫对供试观赏草CAT活性的影响

随胁迫浓度的升高，供试观赏草的CAT 活性均呈先上升后下降的趋势（图2）。在T1 时，紫叶狼尾草、香茅和丽色画眉草的CAT 活性与对照差异显著（P<0.05），其余供试观赏草的CAT 活性与对照相近（P>0.05）。在T2时，金红羽狼尾草、紫叶狼尾草、粉黛乱子草和丽色画眉草的CAT 活性达到最高，分别较对照增加了53.15%、47.77%、55.06%和46.16%；但随着铜、锌质量浓度的持续增加，CAT 活性开始逐渐下降。在T3时，小兔子狼尾草、细叶芒、细叶画眉草和香茅的CAT 活性达到最高，其值分别为30.62、32.60、34.70、35.90 U/g，比各自对照分别增加了66.87%、68.65%、51.73%、76.76%；但在T4处理时则出现明显下降的趋势。

图2 铜锌复合胁迫对供试观赏草CAT活性的影响Fig.2 Effects of Cu2+and Zn2+combined stress on CAT activity of tested ornamental grasses

2.5 铜锌复合胁迫对供试观赏草SOD、POD活性的影响

随着胁迫浓度的升高，所有供试观赏草的SOD活性均呈先增大后减小的趋势（图3）。T1处理金红羽狼尾草、细叶芒和粉黛乱子草的SOD 活性与对照无显著差异（P>0.05），而其余供试观赏草的SOD 活性上升幅度大且与对照差异显著（P<0.05）。T2 处理紫叶狼尾草的SOD 活性达到最大，较对照增加了25.39%，随后在T3 时明显下降。除紫叶狼尾草外，供试观赏草T3 处理SOD 活性均达到最高，在T4 时下降，但仍高于对照。金红羽狼尾草的SOD 活性上升水平最高，在T1—T3 处理，其SOD 活性分别增加7.33%、31.95%和47.92%；其次细叶画眉草和香茅的增加幅度亦较大；丽色画眉草、粉黛乱子草、细叶芒和小兔子狼尾草的增加幅度较小，T3处理分别较对照增加了29.85%、28.89%、24.67%和20.89%。T4所有供试观赏草的SOD活性均开始下降。

图3 铜锌复合胁迫对供试观赏草SOD活性的影响Fig.3 Effects of Cu2+and Zn2+combined stress on SOD activity of tested ornamental grasses

铜锌复合胁迫下供试观赏草的POD 活性均有所提高，细叶芒和香茅随胁迫浓度的升高呈先增后减的趋势，其余6 种供试观赏草均呈逐渐上升的趋势（图4）。细叶画眉草的POD 活性上升幅度最大，在T2—T4 处理时，细叶画眉草的POD 活性显著增加，分别较对照增加了33.59%、54.10%和68.22%。粉黛乱子草的POD活性增加幅度亦较大，T4处理较对照增加了61.27%。小兔子狼尾草和丽色画眉草的POD 活性增加幅度相近，T1—T4 处理分别增加了12.23%～36.25%和8.86%～40.06%。金红羽狼尾草和紫叶狼尾草的POD 活性随质量浓度的升高而增加，且增大的趋势较为平缓。T3 处理细叶芒和香茅的POD 活性达到最高，分别较对照增加了40.82%和32.52%；T4 处理的POD 活性下降，但仍高于对照。

图4 铜锌复合胁迫对供试观赏草POD活性的影响Fig.4 Effects of Cu2+and Zn2+combined stress on POD activity of tested ornamental grasses

2.6 铜、锌质量浓度与供试观赏草生长、抗氧化酶活性指标之间的相关性分析

利用SPSS 进行Pearson 相关性分析以直观体现各变量之间的相互关系。如表4 所示，溶液质量浓度与供试观赏草的生长指标呈显著性相关，其中与胁迫伤害等级呈极显著正相关（P<0.01），与株高、根长分别呈极显著负相关（P<0.01）和显著负相关（P<0.05）。生长指标中的胁迫伤害等级与抗氧化酶活性指标中的MDA 含量、POD 活性呈极显著正相关（P<0.01），这与溶液质量浓度和抗氧化酶活性的相关性结果一致；而株高与MDA 含量、POD 活性呈显著负相关（P<0.05），但均与CAT、SOD 活性无相关性（P>0.05）。株高与根长呈极显著正相关（P<0.01），MDA 含量、CAT 活性、POD 活性、SOD 活性四者之间均呈极显著正相关（P<0.01）。

表4 铜、锌质量浓度与供试观赏草生长、抗氧化酶活性指标之间的相关性分析Tab.4 Correlation analysis of concentration of Cu2+and Zn2+，growth index and antioxidant enzyme activity of tested ornamental grasses

2.7 基于隶属函数法的8种观赏草对铜锌的耐受性评价

运用模糊数学中的隶属函数法，将各个浓度处理下的胁迫伤害等级、株高、根长、MDA 含量、CAT活性、POD 活性和SOD 活性7 个指标相对值的平均值作为实测值，计算各指标的隶属函数值和综合评价值（表5）。8 种供试观赏草对铜锌复合胁迫的耐受性强弱依次为细叶画眉草>金红羽狼尾草>香茅>粉黛乱子草>丽色画眉草>细叶芒>小兔子狼尾草>紫叶狼尾草。

表5 供试观赏草各指标的隶属函数值及综合评价值Tab.5 Membership function value and comprehensive evaluation value of each index of tested ornamental grasses

3 结论与讨论

重金属对植物毒害作用通常表现为抑制植物植株的生长和促进植物的蔫萎死亡[19]。本研究表明，在不同质量浓度的铜锌复合胁迫处理下，8种供试观赏草的生长状况均受到不同程度的抑制作用。细叶画眉草的生长状况最佳，在T1—T2 处理，植株生长与对照无差异，而其余7 种供试观赏草均有出现不同程度的毒害效应；随着质量浓度的升高，细叶画眉草仍能较为正常的生长，而另7 种供试观赏草胁迫伤害等级达到最高，生长严重受限，甚至出现死亡现象。供试观赏草在株高和根长方面存在较大差异，随着质量浓度的升高，金红羽狼尾草和粉黛乱子草的株高及金红羽狼尾草、紫叶狼尾草和细叶画眉草的根长呈先增后减的趋势，这属于低促高抑的现象，其与邹文桐等[20]研究铜锌复合胁迫对菜薹种子萌发、幼苗生长及子叶生理代谢的影响一致。由于重金属铜和锌均是植物生长必需的元素，适量的铜、锌会加速植物体内酶促生理反应，诱导细胞进行有丝分裂，促进其生长；而高浓度铜、锌会使蛋白质变性降解，或导致蛋白质合成酶失活及DNA 转录翻译途径受阻，从而抑制植物叶片蛋白质的合成，植物生长受阻[21]。其余供试观赏草的株高和根长则随质量浓度的增加而逐渐降低，究其原因可能与供试观赏草对铜锌元素比较敏感或设置的初始浓度较高有关。

MDA 作为膜脂过氧化的终产物，亦是检验植物受氧化胁迫程度的生理指标之一。MDA 能够抑制植物体内抗氧化酶活性并降低抗氧化物含量，引发膜脂受到过氧化伤害[22]。本研究表明，8 种供试观赏草的MDA含量较对照均有显著增加，表明铜锌复合胁迫增加了膜脂过氧化反应，且浓度增加，膜脂过氧化反应加重，对植株生长产生胁迫。这与陈艾[23]、邬丝[24]等研究结果一致。植物体内存在2 种抗氧化系统，包括CAT、SOD、POD 在内的抗氧化酶系统以及小分子抗氧化物质，其中抗氧化酶系统用来清除逆境胁迫造成的活性氧，SOD 与清除活性氧自由基，CAT、POD与清除H2O2有关[25]。在正常情况下，植物体内活性氧清除系统能够有效清除体内的活性氧自由基，从而使细胞免受伤害。但在逆境下，植物体内活性氧自由基的产生速度超出了植物清除活性氧的能力，从而引起伤害[26]。本研究表明，所有供试观赏草叶片中的CAT、SOD 活性随质量浓度的升高呈先增后减的趋势，这与周红卫[27]和张廷婷等[28]的研究结果一致。当铜锌复合质量浓度较低时（T1—T2），供试植物的SOD 和CAT 活性有所提升，说明防御酶系统能在重金属低浓度范围内起保护作用[29]，但超过一定量时（T3或T4），2种酶活性开始降低，说明自由基引起的伤害累积超过了防御酶系统的清除能力，抑制了其活性。除细叶芒和香茅外，其余6种供试观赏草的POD 活性均呈增加的趋势。表明供试观赏草为维持抗氧化酶和活性氧体系的平衡，不断提升POD 活性且发挥了重要作用。Pearson 相关性分析结果表明，MDA 含量、CAT 活性、SOD 活性、POD 活性相互之间呈极显著正相关，这与上述研究结果一致，四者协同作用形成一条抗氧化链抵御重金属胁迫对植物造成的伤害。

单一指标并不能全面准确地反映植物对重金属的耐受性强弱，模糊数学中的隶属函数在多指标测定基础上，通过模糊逻辑运算和推理，消除了个别指标带来的片面性，又使各材料耐性差异具有可比性[30⁃32]。因此，本研究采用7个指标的相对值进行隶属函数值计算和综合评价，结果表明，8种供试观赏草对铜锌复合胁迫的耐受性强弱依次为细叶画眉草>金红羽狼尾草>香茅>粉黛乱子草>丽色画眉草>细叶芒>小兔子狼尾草>紫叶狼尾草。