补中益气汤含药血清调控GSK-3β介导的Wnt/β-catenin信号通路增强A549细胞对顺铂敏感性的研究①

王 莹 付权泽 牟琪瑞 刘春英 王 淳 高 原（辽宁中医药大学，沈阳 110847）

肺癌是全球高发的恶性肿瘤，严重影响人类健康，肺腺癌是其较常见的类型［1］。顺铂是肺腺癌一线化疗药物，属于细胞周期非特异性药物，可使肿瘤细胞周期停止，但治疗同时可降低机体免疫功能，并出现多器官毒性损伤［2-3］。顺铂治疗肺癌过程中常因耐药、转移和不良反应降低患者生活质量，影响治疗效果，是临床治疗难题［4-5］。因此，如何增效减毒是当前顺铂治疗肺癌急需解决的问题。补中益气汤是中医“培土生金法”经典方剂，可抑制肺癌生长，与顺铂联合能强化临床疗效，且利于降低不良反应，提高患者生存质量，作用机制值得深入研究［6-8］。课题组前期研究发现，补中益气汤联合顺铂抗肺癌作用优于单独用药，作用机制与抑制PI3K/AKT信号转导通路有关［9-10］。但PI3K/AKT信号通路是一个庞大的信号网络，具体通过其下游哪些通路增强顺铂抗肺癌作用尚未明确。

GSK-3β是PI3K/AKT信号转导通路的下游靶蛋白，也是参与Wnt/β-catenin信号转导通路的关键作用因子［11-12］。Wnt/β-catenin信号转导通路是PI3K/AKT下游最为活跃的细胞途径之一，在肿瘤细胞增殖、侵袭和凋亡中发挥重要作用［13-14］。研究报道，激活Wnt/β-catenin信号转导通路导致其下游靶蛋白survivin表达上调所引起的细胞凋亡抑制可能使肺腺癌对顺铂的敏感性降低［15］。

课题组前期实验虽发现补中益气汤增强顺铂抗肺癌作用与抑制PI3K/AKT信号转导通路有关，但是否与其下游GSK-3β介导的Wnt/β-catenin信号转导通路有关尚未见报道。因此，本研究通过补中益气汤含药血清联合顺铂干预A549细胞，检测GSK-3β介导的Wnt/β-catenin信号通路关键信号分子，进一步探讨补中益气汤增强顺铂抗肺癌作用的分子机制，以期为临床寻求补中益气汤联合顺铂治疗肺癌的有效靶点及相关中药新药开发提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株及动物 SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量190～230 g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（辽）2018-0010。A549细胞株购自中国医科院肿瘤研究中心细胞库。

1.1.2 主 要 试 剂 GSK-3β、β-catenin、survivin、β-actin一抗、全蛋白提取试剂盒、核蛋白和浆蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL发光液、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒均购自沈阳万类生物科技有限公司（批号：WL01456、WL0961a、

WL01684、WL0002、WLA019、WLA004、WLA020、WLA003、WLA001c）；p-GSK-3βser9一抗、RIPA裂解液、羊抗兔IgG-HRP均购自碧云天生物科技有限公司（批号：AG753、P0013B、A0208）；p-GSK-3βtyr216一抗购自英国Abcam生物公司（批号：ab75745）；顺铂购自大连美仑生物技术有限公司（批号：MB1055）；全部药材均购自辽宁中医药大学附属医院药房，并通过辽宁中医药大学药理实验室鉴定。

1.2 方法

1.2.1 含药血清制备 根据新世纪版《方剂学》规定用药量并结合临床常用剂量，补中益气汤组方及剂量为黄芪18 g、甘草9 g、人参6 g、当归3 g、橘皮6 g、升麻6 g、柴胡6 g、白术9 g，按“人和动物之间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算小鼠等效剂量，根据预试验结果筛选最佳中药浓度，最终选取成人推荐日用量作为本次实验中药干预浓度（生药2.91 g/kg），过滤、水浴蒸发至含生药终浓度为每毫升含生药1 g，冷却，4℃保存备用。SD大鼠每天灌胃给药（1.314 g/ml，2 ml）1次，连续7 d，末次给药1 h后，腹主动脉采血置于无菌管，37℃水浴静置30 min，3 000 r/min离心10 min，取上清，重复离心2次，56℃水浴灭活30 min，0.22µm滤器滤过除菌，-20℃冻存备用。

1.2.2 细胞培养及分组 取对数生长期A549细胞，弃培养液，加入0.25%胰酶1 ml消化2～5 min（肉眼观察瓶壁半透明细胞层出现细针孔空隙，或倒置显微镜下细胞变钝圆，细胞间隙增大），即可终止消化，加入含20%胎牛血清的RPMI1640培养液5 ml，无菌吸管轻轻吹打使之均匀悬浮，分装入2个培养瓶，传代继续培养，随机分为4组：a组（对照血清组，10%正常血清处理）、b组（顺铂组，20µg/ml顺铂与10%正常血清共同处理）、c组（补中益气汤组，10%补中益气汤含药血清处理）、d组（补中益气汤含药血清联合顺铂组，20µg/ml顺铂与10%补中益气汤含药血清共同处理），每组作用48 h后收集细胞，用于后续实验。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 各组细胞309 g离心5 min，收集，吸除上清，PBS洗涤2次，309 g离心5 min，收集细胞，吸除上清，残留约50µl PBS，每管细胞样品加入500µl Binding Buffer轻轻重悬细胞，加入5µl Annexin V-FITC混匀，加入5µl PI混匀，室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测。

1.2.4 细胞核浆蛋白分离 各组细胞胰酶消化，收集于1.5 ml离心管，1 000 g离心5 min，弃上清，加入CERⅠ（CERⅠ∶PMSF=100∶1），将预冷的CERⅡ加入1.5 ml离心管，4℃、16 000 g离心5 min，上清即为胞浆蛋白提取物。向装有不能溶解沉淀物（含细胞核蛋白）的原离心管加入预冷NER，4℃、16 000 g离心10 min，上清即为细胞核蛋白提取物。整个细胞核浆分离过程均在冰上操作。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达 收集细胞，以RIPA缓冲液（1×PBS、1%NP40、0.1%SDS、0.1 mmol/L PMSF）于冰上裂解30 min，BCA试剂盒测定蛋白浓度，常规制备蛋白电泳样品，SDS-PAGE凝胶电泳，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗（p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β、β-catenin、survivin，稀释浓度均为1∶500）4℃孵育过夜，二抗（羊抗兔IgG-HRP，稀释浓度1∶5 000）室温孵育2 h，暗室发光，图像扫描并分析结果。以所测蛋白条带与内参条带光密度比值表示蛋白表达。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件处理数据，计量资料用±s表示，各组数据符合正态分布，采用单因素方差分析，方差齐性时，两两比较采用SNK检验；不符合参数检验者，采用多组剂量资料秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补中益气汤含药血清联合顺铂对A549细胞凋亡的影响 与对照血清相比，单独顺铂、补中益气汤含药血清联合顺铂均能显著提高A549/顺铂细胞晚期凋亡率（P＜0.05），单独补中益气汤含药血清并未显著提高晚期凋亡率（P＞0.05）。与单独顺铂相比，补中益气汤含药血清联合顺铂提高晚期凋亡率效果更为显著（P＜0.05，图1、表1）。

表1 补中益气汤含药血清联合顺铂对A549细胞凋亡率的影响（±s）Tab.1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing serum combined with cisplatin on apoptosis rate of A549 cells（±s）

表1 补中益气汤含药血清联合顺铂对A549细胞凋亡率的影响（±s）Tab.1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing serum combined with cisplatin on apoptosis rate of A549 cells（±s）

Note：Compared with a group，1）P＜0.05；compared with b group，2）P＜0.05.

Groups a b c d Late apoptosis rate（%）4.57±0.13 18.29±1.421）6.54±0.752）29.59±1.241）2）

图1 补中益气汤含药血清联合顺铂对A549细胞凋亡率的影响Fig.1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing serum combined with cisplatin on apoptosis rate of A549 cells

2.2 补中益气汤含药血清联合顺铂对A549细胞GSK-3β在细胞浆、细胞核中活性表达的影响 顺铂可显著下调胞浆p-GSK-3βser9表达（P＜0.05），而补中益气汤含药血清联合顺铂可进一步下调胞浆p-GSK-3βser9表达（P＜0.05），但补中益气汤含药血清对胞浆p-GSK-3βser9表达无显著影响（P＞0.05）；顺铂、补中益气汤含药血清、补中益气汤含药血清联合顺铂对A549细胞胞浆GSK-3β、p-GSK-3βtyr216表达均无显著影响（P＞0.05，表2、图2A）。顺铂可显著下调胞核p-GSK-3βser9表达（P＜0.05），而补中益气汤含药血清联合顺铂可进一步下调胞核p-GSK-3βser9表达（P＜0.05），但补中益气汤含药血清对胞核p-GSK-3βser9表达无显著影响（P＞0.05）；顺铂、补中益气汤含药血清、补中益气汤含药血清联合顺铂对A549细胞的细胞核GSK-3β、p-GSK-3βtyr216表达均无显著影响（P＞0.05，表3、图2B）。

表2 A549细 胞 浆p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表达（±s，n=3）Tab.2 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in cytoplasm of A549 cells（±s，n=3）

表2 A549细 胞 浆p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表达（±s，n=3）Tab.2 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in cytoplasm of A549 cells（±s，n=3）

Note：Compared with a group，1）P＜0.05；compared with b group，2）P＜0.05.

Groups a b c d p-GSK-3βser9 1.00 0.38±0.091）0.88±0.072）0.20±0.051）2）p-GSK-3βtyr216 1.00 0.92±0.01 0.87±0.05 0.85±0.06 GSK-3β 1.00 0.98±0.04 0.99±0.01 1.10±0.07

图2 A549细 胞 浆、细 胞 核p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表达Fig.2 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in cytoplasm and nucleus of A549 cells

表3 A549细 胞 核p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表达（±s，n=3）Tab.3 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in nucleusof A549 cells（±s，n=3）

表3 A549细 胞 核p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表达（±s，n=3）Tab.3 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in nucleusof A549 cells（±s，n=3）

Note：Compared with a group，1）P＜0.05；compared with b group，2）P＜0.05.

Groups a b c d p-GSK-3βser9 1.00 0.56±0.091）0.88±0.072）0.40±0.051）2）p-GSK-3βtyr216 1.00 0.99±0.04 1.07±0.02 0.92±0.03 GSK-3β 1.00 0.98±0.06 1.01±0.03 0.94±0.02

2.3 补中益气汤含药血清联合顺铂对A549细胞β-catenin、survivin蛋白表达的影响 与对照组相比，顺铂可显著下调A549细胞β-catenin、survivin蛋白表达（P＜0.05），补中益气汤含药血清未使A549细胞β-catenin、survivin蛋白表达发生显著变化（P＞0.05）；而补中益气汤含药血清联合顺铂可使A549细 胞β-catenin、survivin蛋白表达显著下调（P＜0.05），同时也较顺铂单独处理的β-catenin、survivin蛋白表达显著下调（P＜0.05，表4、图3）。

表4 A549细胞β-catenin、survivin蛋白表达（±s，n=3）Tab.4 Expressions ofβ-catenin and survivin protein in A549 cells（±s，n=3）

表4 A549细胞β-catenin、survivin蛋白表达（±s，n=3）Tab.4 Expressions ofβ-catenin and survivin protein in A549 cells（±s，n=3）

Note：Compared with a group，1）P＜0.05；compared with b group，2）P＜0.05.

Groups a b c d β-catenin 1.00 0.76±0.051）1.07±0.062）0.42±0.031）2）survivin 1.00 0.47±0.131）1.18±0.052）0.25±0.101）2）

图3 A549细胞β-catenin、survivin蛋白表达Fig.3 Expressions ofβ-catenin and survivin proteins in A549 cells

3 讨论

中医学认为癌症是正气虚弱、邪气过盛所致，加之化疗药物的毒副反应，使患者正气更加虚弱，无力对抗邪气。根据五行规律，土属脾，金属肺，脾为肺之母，脾散精以充肺，即“培土生金”。脾转输津液，散精于肺，不仅是肺通调水道的前提，也为肺生理活动提供营养。肺脾二脏在病理上相互影响，脾气虚损时，常导致肺气不足，邪气入侵，引发肺病。因此，中医治疗肺癌常用“培土生金”法，通过补益正气，抵抗邪气，从而抵御肿瘤。如李东垣所创的补中益气汤作为“培土生金”法的经典方剂，临床常用于晚期肺癌治疗，能提高机体免疫功能，增加化疗药物敏感性，改善患者生存状况［7-8］。但中医治疗肺癌的研究中，尚未见“培土生金”法通过调控GSK-3β介导的Wnt/β-catenin途径增强肺癌对顺铂敏感性的报道。

目前认为GSK-3β是PI3K/AKT信号通路的效应靶蛋白，p-AKT可引起GSK-3βser9磷酸化［16-17］。GSK-3β是一种普遍存在在于细胞内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是公认的Wnt/β-catenin信号通路信号分子［18-19］。GSK-3β活性受两个磷酸化位点的控制，GSK-3βser9磷酸化可抑制GSK-3β活性，GSK-3βtyr216磷酸化提高GSK-3β活性［20-21］。本研究发现，顺铂可下调A549细胞胞浆p-GSK-3βser9表达，补中益气汤含药血清联合顺铂可进一步下调p-GSK-3βser9表达，从而增加胞浆中GSK-3β表达，增强肺腺癌细胞对顺铂的敏感性。

正常情况下Wnt/β-catenin信号通路未被激活，细胞浆中β-catenin会被GSK-3β磷酸化，进而启动泛素化被降解，维持细胞浆中较低水平的β-catenin［22］。而病理情况下，p-GSK-3βser9表达升高，抑制GSK-3β活性，从而使β-catenin在肿瘤细胞内积蓄［23-24］。当细胞浆中β-catenin大量积蓄，β-catenin转移至细胞核与TCF/LEF家族转录因子结合，从而启动下游靶基因，如survivin等［25］。本研究显示，顺铂可下调A549细胞β-catenin、survivin蛋白表达，补中益气汤含药血清联合顺铂可进一步下调A549细胞β-catenin、survivin蛋白表达，说明补中益气汤有助于顺铂抑制Wnt/β-catenin信号通路激活。

survivin是Wnt/β-catenin信号通路下游靶蛋白之一，同时是一种抗凋亡蛋白，生理情况下，细胞内较低水平s urvivin会导致细胞凋亡［26-27］。但当大量β-catenin在细胞内积蓄并转移至细胞核激活s urvivin蛋白时，使细胞凋亡受抑制，进而导致药效降低［28］。本研究证实单独顺铂和补中益气汤含药血清联合顺铂均能显著提高肺腺癌细胞晚期凋亡率，且后者促进凋亡效果优于前者，说明补中益气汤可增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性。

综上，补中益气汤含药血清联合顺铂可抑制p-GSK-3βser9表达，从而增强GSK-3β活性，进一步影响Wnt/β-catenin信号通路，下调β-catenin、survivin蛋白表达，促进肺腺癌细胞凋亡，增强顺铂敏感性。本研究深入揭示了补中益气汤联合顺铂抗肺癌作用优于单独用药的分子机制，为临床寻求补中益气汤联合顺铂治疗肺癌的有效靶点及相关中药新药开发提供新的依据，有助于临床制定合理的肺癌治疗方案，提高患者生存率和改善患者生存状态。此外，研究结果部分揭示了中医“培土生金”的本质，并为临床拓展中药协同顺铂治疗肺癌的病机与治法理论提供新的思路。