Toll样受体及其对水生动物疾病调控作用的研究进展

梁利国　陈凯　谢骏

摘要：Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是近年来倍受关注的一类模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs），在病原识别、介导机体免疫反应中发挥着重要作用。本研究对Toll样受体的发现、种类、结构、分布、配体及其信号转导途径与功能、在水生动物疾病调控中的作用进行了概述，以期进一步了解TLRs在水生动物疾病中所起的关键作用。

关键词：Toll样受体；水生动物；信号转导；疾病调控

中图分类号：S941.4 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0012-04

宿主对病原体的防御反应主要依靠免疫系统。免疫系统分为先天性免疫和获得性免疫2种，其中获得性免疫以T细胞和B细胞为媒介且仅存在于哺乳动物体内，而先天性免疫在无脊椎动物到脊椎动物体内普遍存在。Toll样受体是一种广泛存在于哺乳动物、昆虫及植物体内的天然免疫分子，属于高度保守的蛋白家族成员，最早于1988年在果蝇体内发现。后期研究显示，该受体在病原微生物识别、机体免疫等方面具有重要意义。

1.TLRs的种类、结构及分布

迄今为止，果蝇体内的TLRs在先天免疫中的作用被广泛探讨，9种TLRs先后被发现于果蝇体内并进行了后续研究。之后又在人体、小鼠及真菌中克隆出10种TLRs的同源序列。所有的TLRs蛋白都属于I型横跨膜蛋白，具有相同的结构特征，由胞外区、跨膜段和胞内区3部分组成。胞外区富含亮氨酸重复序列（1eucn-rich repeats，LRR）并有1个富含半胱氨酸的区域。胞内有1个被称为Toll/IL-1（Toll/in-terleukin-1，TIR）的高度保守区域。

2000年，鱼类首个TLR超家族成员分离出来。其后，TLRs陆续从河豚、斑马鱼和牙鲆中分离出来，并证实鱼类不仅具有哺乳类所有TLR种类的同源基因，还具有几个在哺乳类尚未发现的TLR种类。学者们在河豚基因组的研究中，通过与人类相关基因的对比，并未发现人类TLR4的同源序列，这意味着河豚可能缺少TLR4基因；而在随后关于斑马鱼的研究中发现，其TLR4分子有2个亚型，这说明TLR4分子的缺失并非存在于鱼类的普遍现象。

TLRs在淋巴组织和非淋巴组织均有表达，但TLRs在不同的组织和细胞表达量有所不同。泛生型主要是TLRl，广泛分布于多核细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞、NK细胞、成纤维细胞及树突状细胞等多种细胞表面。局限型包括TLR2、TLR4和TLR5，主要分布于髓系单核细胞，其中外周血白细胞的表达最为丰富。特异型即TLR3，仅存在于树突状细胞表面。

2.LRs的配体及信号转导途径

2.1TLRs的配体

天然免疫识别系统是由能够识别病原相关的分子模式（pathogen-associated molecule pattern，PAMPs）的模式识别受体（pattern recognition receptors，PPRs）介导的。TLRs作为重要的模式识别受体可识别多种病原体广泛表达的脂类、碳水化合物、肽和核酸结构。研究证实大多数TLRs形成同二聚体，而TLR2则能以异二聚体TLRl/TLR2和TLR2/TLR6的形式存在，以鉴别配体结构的精细改变。TLRl0是最新发现的人TLR，与TLRl和TLR6氨基酸组成高度同源。常晓彤等在其研究中指出TLRl0与TLRl结构相似，具有与TLR2形成二聚体的接口和脂肽结合的通道，在天然免疫识别中以激动剂依赖的方式与TLR2相互作用。TLR2能够识别多种PAMPs，包括G+的肽聚糖、细菌脂蛋白、支原体脂蛋白等。TLR2能识别如此广泛的PAMPs，是由于其可与至少2个其他TLR家族成员TLR6、TLRl形成异二聚体，从而增强其识别功能。TLR3可识别病毒双链RNA（dsRNA）以及人工合成的类似物多聚肌胞苷酸poly（I：C）。TLR4是首个被发现的哺乳动物Toll样受体，其主要功能是作为革兰氏阴性菌LPS的信号转导受体。除此之外，还可识别内源性分子热休克蛋白60（HSP60），但TLR4识别HSP60的具体功能有待进一步研究。TLR5是识别具有鞭毛蛋白的细菌的重要受体。TLR9可识别甲基化的CpG-DNA 。

2.2TLRs的信号转导途径

由于TLRs胞内区域与IL一1R的胞内区域同源性较高，并有特征性的TIR区域，所以它们的信号传递链基本相同，但对不同信号的刺激仍有所区别。现已明确参与此信号途径的分子有MyD88、IRAK、TRAF6等。

髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是TLRs信号通路中重要的衔接蛋白。MyD88分子由296个氨基酸残基组成，其羧基末端为TIR结构域，氨基末端为死亡结构域（death domain，DD）。羧基末端TIR结构域和胞浆内TLRs的TIR结构域结合，MyD88即依赖其死亡结构域与下游接头分子相互作用形成受体复合物，进一步募集下游信号分子。利用MyD88基因敲除小鼠模型进行试验，结果发现MyD88缺陷鼠除了正常应答TLR3配体外，其他TLR配体均不能引起应答反应，TLR3是至今已知的唯一不通过MyDS8的Toll样受体。目前的相关研究中，一般根据TLRs的信号转导过程是否有MyDS8的参与将TLRs信号通路分为MyD88依赖性和MyD88非依赖性。MyD88依赖性信号通路主要介导炎性细胞因子的产生，而MyD88非依赖性信号通路主要介导调节树突状细胞（DC）的成熟以及其他免疫调节分子如MHC、CD80等的表达。

2.2.1MyDS8依赖性信号途径研究表明除TLR3外，其他所有的TLRs信号转导过程都有MyDS8的参与。TLRs结合MyD88后，白介素1受体相关激酶4（IL-1R-associatedkinase 4，IRAK-4）和白介素1受体相关激酶1（IRAK-1）被募集并磷酸化。活化后的IRAK一4和IRAK一1与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNFR-associated factor6，TRAF6）结合，使TNFR6磷酸纤维素化后促使转化生长因子β活化激酶1（transforming growth factor-βactivated kinase 1，TAKl）活化。TRAF6活化引起2条不同途径的信号转导，一条包括P38MAPK家族和c-junNH2-tetminal激酶（111k）；另一条是活化MPKKK（mitogen-activated protein kinase，MAP3K）家族成员NIK（NF-IB-inducing kinase），后者的磷酸化激活IJB激酶（I.IB kinases，IKKs），导致IJB的泛素化而从IJB/NF-KB复合物释放，NF-KB由此活化转位进核，导致一系列特定基因的表达，从而产生原发性致炎因子如TNF-A、IL-1等完成炎症的信号转导过程。

2.2.2MyD88非依赖性信号途径TLR3的信号转导不触发MyD88途径，而是利用另一种适配蛋白TRIF。NF-KB和AP-1的活化是所有TLRs介导的信号途径的共同特征，但只有TLR3可诱导1种具有强大的抗病毒、抗菌能力的细胞因子一I型干扰素的产生。TLR4既可利用MyD88依赖性信号途径，也可利用同TLR3相似的以TRIF为适配蛋白产生I型干扰素的MyDS8非依赖性信号途径。然而TLR4还需要TIRAP和TRAM额外2种适配蛋白，这2种蛋白调控TLR4对MyD88依赖性途径和MyD88非依赖性途径的选择。TRIF基因敲除鼠试验进一步证实了该基因在TLR3信号传导途径中的重要作用。此外，Gao等的研究中，利用转染的siRNA阻断MyD88在HT一29细胞中的表达，结果发现，由酪酸梭菌刺激的TLR2调控通路也可利用MyD88非依赖性途径实现信号的转导。

3.TLRs的功能及在水生动物疾病中的调控作用

3.1炎症反应

中性粒细胞是典型的先天性免疫细胞，而TLRs是典型的先天免疫受体。人体中性粒细胞可表达大多数的TLRs。Hayashi等对TLRs刺激下中性粒细胞的功能研究中发现，在病原入侵机体时，TLRs可增强吞噬细胞的吞噬能力。Hirono等在牙鲆的相关研究中观察到，在迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）刺激下，牙鲆肾脏中有脓肿，表明诱发了炎症反应，脓肿周围大量表达MyDS8基因，说明MyDS8在牙鲆炎症反应中起重要作用。付媛媛等给中国明对虾投喂含不同浓度黄芩的饲料，之后利用鳗弧菌感染对虾，结果显示，3个试验组的TLR基因mRNA的表达量均受到抑制，从而抑制先天免疫系统产生炎症因子，相对提高了吞噬细胞的吞噬能力，增强天然免疫细胞的杀伤能力。

3.2抗病毒感染

TLR3是目前研究比较详细的双链RNA病毒模式识别受体之一。而鱼类的TLR22是另一种可识别双链RNA病毒的因子，它广泛存在于各种鱼类的基因组。可能是由于鱼类生活在水体环境，经常受到病毒的侵袭，在自然选择的作用下保留了双链RNA病毒双重识别系统。

杨春荣等在研究草鱼TLR3表达特征时发现，草鱼感染呼肠孤病毒后TLR3基因的相对表达量显著升高，并指出TLR3基因在呼肠孤病毒感染中发挥着重要作用。之后在斑节对虾的相关研究中，TLR22的表达量也表现出类似结果。TLR家族中除TLR3及TLR22外，TLR7也具有病毒识别能力。TLR7亚家族由TLR7、TLR8和TLR9构成，主要参与抗病毒机制的激活，病毒单链RNA可以成为TLR7和TLR8的配体，TLR9主要识别病毒或细菌含有非甲基化的CpG-DNA。张荣芳等探究TLR7在草鱼体内和体外的表达模式时发现，病毒感染后的草鱼肝脏、脾脏中的TLR7表达与对照组相比均显著提高，这种显著性差异反映了TLR7在病毒感染中的应答效应。吴立舒在试验中也观察到，受到蛙虹彩病毒威胁时，东北林蛙皮肤中TLRl和TLR8的mRNA表达量在攻毒后的6h内迅速上调表达。

3.3病原菌识别

细菌以细胞壁不同的染色特征可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌2大类。细胞壁上某些特殊成分可以作为PAMPs被TLRs所识别。LPS是广泛存在于细胞壁的最有效的免疫刺激剂。

TLR2和TLR4均可识别LPS，但在许多情况下需要协同受体的存在，其中TLR2常与TLRl及TLR6形成异二聚体共同发挥作用。Basu等用无乳链球菌和嗜水气单胞菌（AeFomonas hydrophila）对印度鲮（Cirrhinus mrigala）进行侵染，之后在其鳃、肝脏、肾、肠及血液等组织中检测到TLR2的表达。结果表明TLR2在机体的许多组织中充当着免疫监视者的角色，可诱导产生IL-8和TNF-α2种细胞因子对入侵机体的病原菌发生免疫应答。梁建平从凡纳滨对虾体内克隆出TLR6并以灭活的金黄色葡萄球菌、创伤弧菌及酿酒酵母分别作为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌3类微生物的代表对虾进行免疫刺激，随后测量肝胰脏TLR6基因表达水平。结果显示TLR6在金黄色葡萄球菌、酵母刺激下均出现显著上调，创伤弧菌则只在72 h时间段内出现较大上调。在病原刺激下TLR6出现较大幅度的上调可以理解为机体对外来刺激产生的防御反应。

TLR5对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的鞭毛蛋白均能识别，且鞭毛蛋白是哺乳动物体内TLR5唯一识别的受体。鱼类具有和哺乳动物同源的TLR5基因，且TLR5S基因是鱼类所特有的，它与TLR5共同参与鱼类免疫反应。李敏等用迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、链球菌（streptococcus）和斑点又尾鲴呼肠孤病毒（Channel cathemorrhage FCGCUFI，CCRV）进行感染试验，结果显示TLR5和TLR5S在细菌刺激下，均有不同程度的上调表达，而在CCRV刺激下除了感染后12h的头肾和肝脏中表达量有轻微上调外，其他情况下均表现为明显的下调表达，这可能与TLR5能识别细菌的鞭毛蛋白而不能识别病毒有关。当TLR5与配体蛋白结合后，通过MyDS8依赖性途径激活NF-KB，进而诱导细胞因子及前炎症因子的产生。林克冰等利用哈维氏弧菌（Wbrio harveyi）感染斜带石斑鱼，在感染后3、6、12、24、48h后利用Real tlne PCR检测TLR5S在肝脏中的表达情况，结果显示TLR5S基因在3、6、12、24h时表达量显著上调，而在48h下降至初始水平。推测此现象是由于哈维氏弧菌感染刺激早期，机体为了清除入侵病原，诱导TLR5S基因的表达，参与机体免疫应答。随时间推移，机体中的病原逐渐被清除，TLR5S基因表达随之下降。TLR5可在单核细胞、未成熟树突状细胞及上皮细胞中表达，是一种参与免疫应答的受体，TLR5和TLR4一起，可以识别鞭毛蛋白并激活干扰素调节因子3（IRF-3）。欧阳蒲月等对硬骨鱼类中斑马鱼的TLR5在受到杀鲑气单胞菌（革兰氏阴性菌，G）、金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌，G+）刺激之后的表达变化进行了研究，结果显示，G+和G-细菌的感染都诱发了TLR5表达的上调，不具有鞭毛的金黄色葡萄球菌也可以诱发TLR5表达的上调。作者认为此情况是由于具有鞭毛的革兰氏阴性菌可以直接激活TLR5通路，而不具有鞭毛的革兰氏阳性菌可能先激活Toll样受体家族的其它通路，再诱导TLR5表达活跃，从而实现对外源微生物入侵的抵御。

3.4其他调控作用

体内和体外研究均表明，硬骨鱼的TLRs可对许多细菌和寄生虫的PAMPs作出应答。乔玮等从斜带石斑鱼体内克隆出TLR3基因，并通过刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）感染斜带石斑鱼，感染后发现在皮肤和肝脏中均有不同程度的应答反应。

TLRs不仅可以调控天然免疫，也同样介导获得性免疫反应。在天然免疫和获得性免疫间起中间桥梁作用的是抗原提呈细胞（APC）。APC表达所有的TLRs，病原体特有的PAMPs被APC上的TLRs识别后诱导活性氧中间物（ROI）和活性氮中间物（RNI）的产生，释放前炎症因子并上调共刺激分子的表达，随后启动获得性免疫。

4.展望

TLRs是一组与天然免疫密切相关的受体家族，在天然免疫防御中起着重要作用，并能激活获得性免疫系统。近年来，随着分子生物学、免疫学等学科的发展，Toll样受体的研究和应用进入了迅速发展的新阶段。鱼类的Toll样受体也被陆续克隆出来，并在疾病控制、免疫应答方面获得一些研究成果。随着科学技术的发展，鱼类的TLRs家族将得以更深一步的研究，为病毒、病原菌、寄生虫等引起的疾病防治提供新的科学思路与方法。针对TLRs为靶点的药物研究也正成为一个热点。通过对TLRs不断深入研究，免疫激动剂、疫苗将得到进一步开发与研制，水产动物的疾病防治将不再过多依赖于抗生素。总之，随着对TLRs研究的不断进展，将会为水产动物疾病防治提供更加有效、更为安全的新方法。