血浆病毒灭活技术的研究进展

李艳

富川瑶族自治县人民医院 广西 贺州 542700

以往应用采血塑料袋、抗凝剂与血细胞保存方式不断改进，血库可充分满足用血需求。近日，医学的进步下，临床用血不断提高，成分输血比例渐渐增长，公众对医学认知水平得到大幅度提升，法律意识也不断增强，对血液的安全性更加重视。为保障血液安全性，血液检测项目渐渐增加时，血液检测技术得到明显改进[1]。截至目前，输血传播病毒的测定方式不仅仅局限在血清学的测定上，很多发达国家已有分子生物学检测技术，如：核酸检测技术（NAT），我国部分血站同样在实验室开展此项目。血浆占全血55%，血浆输注在各类血液成分输注中占比较大[2]。另外，因输血传播病毒在多种血液成分中分布不够均匀，多种血液成分传播病毒危险性不同，白细胞病毒传播风险高，接下来即血浆，相对安全的是红细胞与血小板。所以，科学预防血浆输注风险，提高血浆输注安全性，一直是输血医学中极为关注的问题，有助于提高输血安全性。

1 新鲜冰冻血浆/冰冻血浆定义

（1）新鲜冰冻血浆：采集后保存在冷藏环境中全血，在6h-8h内完成血浆分离，速冻，自血液采集到完成血浆分离最长时间不得超过18h，分离出血浆后，速冻呈固态成分血，若制备冷沉淀新鲜冰冻血浆，新鲜冰冻血浆采集后10h内完成速冻[3]。

（2）冰冻血浆：用物理方式在全血有效期中，分离出血浆，速冻呈固态的成分血。

2 血浆制备、热合、包装、速冻

2.1 血浆制备

（1）观察血浆外观标签颜色是否符合要求，血浆可不开展2次离心，排除血浆中气泡后，用塑料夹夹紧转移袋导管[4]。接着在电子称上称取对应规格的血浆。将血浆袋放在计重称重，容量依据血浆100ml/袋，血浆150/袋，血浆200ml/袋，血浆100mg/袋，连袋重118-138g，取118-138g，血浆150ml/袋，连袋重164-195g，取164-138g，血浆150ml/袋，连袋重在164-195g，取164-195g，血浆200ml/袋，连袋重210-252g，取210-252g[5]。

（2）若血浆中红细胞混入量较多，经2次重离心后，将原血浆袋置入在分浆夹中，松开塑料夹，分离出上层清液，将其转移至空的联袋重。

2.2 热合

血浆袋近端导管上大约5cm-7cm处热合和联袋分开，用手挤压检查热合口是否有渗漏后断离。仔细检查每袋血浆信息，隔离不合格品，填写《不合格品申请处理单》开展评估判断[6]。

2.3 包装

为每袋血浆经严格目测，确定无渗漏无损坏等迹象，用蓝色油性笔于血浆袋下角签上检查者工作号，用不容种类的专用盒分别包装，放置在速冻机速冻[7]。

2.4 速冻

血浆制品经迅速冷冻在60min内使血浆核心温度下降-30℃，按照操作规程执行速冻。

电脑信息录入：落实《血液产品包装系统与血液处理与加工系统操作规程》。

3 血浆病毒灭活的意义

输血是治疗诸多疾病的重要方法，同时输血也可传播一些疾病，而如何避免输血传播疾病，是目前医务工作者和广大患者共同关注的话题。血浆输注存在的风险较大，容易传播病毒、细菌等。一般认为，HBV、HCV、CMV、逆转录病毒经血浆输注传播。从美国的一份报告中得出，输注一个单位全血血液成分病毒感染率：HBV大约1/63000；HCV大约1/100000；HIV大约1/680000[8]。部分微生物，如：锥虫属、巴贝虫属类病毒微生物可经血浆传播。

4 现有检测技术不足

一些病毒对血液成分安全存在威胁，检测血液技术不断改进，然而，检测技术也有不足之处，感染病毒学依然可能逃避检测系统，是传播疾病的根源。很多实验室对血液病毒的检测依然在血清学水平停留，对HBV、HCV、HIV检测用病毒标志物酶白技术完成[9]。因存在“窗口期”，已经感染病毒的血液病毒标志物的测定呈阴性，容易漏检。

美国曾报道，大约90%漏检血液是因“窗口期”原因，我国上海经研究表示我国同样如此。部分实验室开发病毒核酸检测技术（NAT），病毒检出率较高，但是HBV、DNA在56d“窗口期”间含量低下，检测NAT难度高[10]。对HCV，同样有这样的问题。有报道称：输注通过NAT检测合格血液后感染HCV病例。接着，NAT费用较高，是推广路上的障碍。

不仅这样，CMV、HAV、HEV，较小病毒B19，细菌、微生物选择未列到常规监测项目，同样是输注血液中的安全问题。

5 血浆病毒灭活技术

5.1 亚甲基蓝化学法

亚甲基蓝化学法是现阶段血浆病毒灭活最常用的方法，其对病毒的灭活效果，和亚甲基蓝浓度之间存在密切联系。亚甲基蓝是酚噻嗪类染料，是一种解毒剂，其通常在氰化物中毒、亚硝酸盐中毒患者中国应用。这一方法对血浆病毒的灭活机制为：亚甲基蓝为多把点光致敏剂，其于600～700nm波长的可见光照射下，可形成单线态氧等自由基状态，这一类活性氧能够促使核酸链上鸟嘌呤发生变化，形成8-羟鸟嘌呤，致使托嘌呤与核酸链彻底断开；同时，促使蛋白质与蛋白质之间、核酸与蛋白质之间形成共价交联，同时这一物质还可结核病毒脂双层，导致病毒莫发生损伤，且这一损伤不可逆转，进而达到病毒灭活的效果。

任何一种病毒灭菌方法，都或多或少会对血浆制品的质量造成影响，这是难以避免的，而亚甲基蓝化学法对血浆制品的质量影响相对较小。苑玉凤[11]等人选取10份新鲜血浆，分别应用亚甲基蓝光化学法和巴斯德液态湿热法来对病毒进行灭活，之后对比灭活后血浆中各项有效成分的含量，发现经亚甲蓝光化学法进行病毒灭活后血浆中纤维蛋白原、总蛋白和凝血因子Ⅷ的含量均显著高于巴斯德液态湿热法(p＜0.05)，作者得出结论，亚甲蓝光化学法灭活病毒的血浆,对血浆成分的影响较小。正因如此，亚甲基蓝化学法在病毒灭活中的应用十分广泛。

5.2 亚甲基蓝（MB）结合光照（Light）方式

除亚甲基蓝化学法之外，光照方法也是病毒灭活的一种常用方法，且这两种方法常结合起来应用。最近几年，有研究用MB/光照对部分RNA/DNA病毒灭活，取得效果良好[12]。因为MB为正电荷，阳离子和核酸亲和力较高，特别是鸟嘌呤残基亲和作用良好。在这期间，因MB带正电荷，经一定波长会发现光照射，步入激发状况。自激发态返回初态时，大量释放能量，向周围氧分子传递，氧分子是活跃的氧原子，将病毒脂包膜破坏，消灭病毒。所以，这种方式对包膜病毒极为有效。

在我国，有研究用MB/光照对血浆开展病毒灭活，经研究得出：MB/光照病毒灭活血浆中，几乎全部所有包膜病毒均会被灭活，但对无包膜的病毒无效果[13]。

这种方式灭活病毒，操作方便，仅需将无菌MB直接添加在融化的冰冻血浆中，借助适当波长光照干预，达到灭活病毒效果。MB/光照对血浆干预后，血浆中VSV病毒滴度会大幅度降低，上升到国际公认的血浆病毒灭活有效指标。灭活条件不同，灭活效果不同。如：MB浓度、光照强度不同，灭活病毒效果存在差异。

这种方式能够完成对单人份血浆病毒灭活，无需像S/D干预的血浆自病毒灭活后自血浆分离去污剂，全部操作均简单易行。

但是，这种方式依然有难以克服的缺点，利用这种方式灭活病毒后，血浆蛋白的含量、活性会发生转变。另外，有研究表示：人体中聚集大量的MB，容易造成潜在的突变。美国，这种方式无法取得FDA认可[14]。所以，这一方式在世界范围中未被所有国家采用。

5.3 按核酸为靶点的光化学技术

这类灭活病毒技术即核酸打靶技术，一般用核酸特异性加合形成实现病毒灭活的介导。最近几年，补骨脂素介导光化学技术渐渐发展成熟。目前，这一技术还比较新颖，在临床中的应用相对较少，要想在临床中真正运用这一技术，还有赖于相关装置的研发及技术的不断进步。

5.4 补骨脂素联合紫外线（UVA）照射灭活病毒技术

补骨脂素分子会可逆插入DNA、RAN螺旋体重。经UVA照射后，补骨脂素分子、核酸分子中嘧啶碱基共价联合。若补骨脂素分子插进相邻嘧啶碱基之间，核酸链共价交叉相连。若交叉连接DNA、RNA螺旋体难以得到及时修复，无法继续精准复制，DNA、RNA病毒会灭活。因DNA、RNA存在各细胞核中，血浆中无科学的有核细胞治疗成分，血浆自身不适成为补骨脂素技术的打靶点，通过上述病毒灭活技术干预后，血浆治疗功能会完好无损。

5.5 核黄素介导的光化学技术

核黄色，即维生素B2，其分子是多环共价联合的平面结构，存在一条糖基侧链，具有水溶性[14]。平面构造是确保核黄插进DNA或RNA的碱基构造基础。核黄色易穿透病毒细胞膜，与DNA、RNA联合，经短暂的波长光照后，DNA螺旋、RNA上鸟嘌呤碱基断裂，DNA、RNA受损，从而对病毒、细菌等病毒的转录与翻译进行抑制，遏制其持续复制，发挥灭活病毒作用。因血小板、红细胞无DNA，所以维生素B2对其无破坏效用。维生素B2有水溶性，易穿透细胞膜，会直接穿透细胞膜，作用在诸多无包膜病毒、细胞中病毒。

早于1965年，即有学者开展维生素B2联合会发现光或紫外线光照灭活病毒研究，其数据说明此技术极为可行。

一般状况下，人体需自外界取得维生素B2，保持红细胞细胞膜完整，加入新陈代谢。有研究表明：维生素B2介导的光化学技术灭活病毒后，维生素B2降解产物、摄取的维生素B2自人体正常代谢产物一致。

核黄素灭活血浆病毒研究尚处在初期环节，迄今为止，依旧未发现公开发表的言论，互联网与部分专业杂志对应报道较少。有研究用维生素B2是光敏剂，添加在猴子体内的血小板中，此血小板悬浮在30%血浆、70%添加液中，波长＞350nm可见光与紫外线混合照射后，立即在猴子体内输注，血小板中病毒被激活[15]。将新鲜冰冻血浆（FFP）融化后，将其与模型病毒孵育，添加核黄色，借助紫外线照射，照射期间摇晃均匀。控制温度为30℃。由结果得出：这种方式可实现血浆中模型病毒灭活，且对有包膜、无包膜病毒均有一定作用。[16]

6 小结

综上所述，在输血治疗中，血浆病毒灭活过程是必不可少的，是降低疾病传播的关键方法。病毒灭活技术的成功下，临床血浆输注会更为安全，开辟血浆输注的新路径。目前，血浆病毒灭活技术取得进步较大，如核黄素介导的光化学技术，为血液安全性供应可靠路径。在后续研究中，还有待于相关技术及相关装置的不断发展，才能为输血安全提供有力保障。