胆汁淤积性肝损伤炎性反应机制的研究进展

康锦钰，罗 佳，高泽天，郑文涛，刘爱明，宋毓飞

(1.宁波大学 医学院, 浙江 宁波 315211； 2.宁波大学附属李惠利医院， 浙江 宁波 315211)

肝细胞以胆固醇为原料，经由复杂的酶促反应合成胆汁酸(bile acids，BAs)后，分泌到胆管，然后储存在胆囊中；摄入食物后，BAs流入肠道，协助脂溶性营养物质的消化与吸收，最后经门静脉重新转运至肝脏[1]。胆汁淤积症(cholestasis)是由于免疫、遗传、药物和妊娠等多种因素引起BAs代谢稳态破坏，并导致毒性BAs在肝细胞、肝胆管和肝外胆道积聚的疾病[2]。常见的肝内胆汁淤积症病因包括原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)、非酒精性脂肪肝、药源性肝损伤和妊娠期肝内胆汁淤积症等。持续胆汁淤积激发炎性反应导致的肝细胞损伤称为胆汁淤积性肝损伤(cholestatic liver injury，CLI)，若未及时纠正， 将进一步导致胆管增生、纤维化，并发展为肝硬化、肝衰竭和肝癌等[2]。

1 介导CLI发生的“直接毒性论”和“凋亡论”

实验研究表明，BAs的脂溶性是决定BAs毒性的重要因素，BAs的脂溶性越强，肝毒性越强[3]。早期的研究多集中在BAs对肝脏的直接毒性作用，在体外实验中，高浓度(1.5～2 mmol/L)的BAs可基于表面活性剂作用，直接破坏肝细胞膜，导致肝损伤[4]。然而，临床胆汁淤积梗阻患者血清中毒性BAs组分甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid,GCDCA)实际浓度范围在22～32 μmol/L，远低于体外实验浓度水平；而且使用28 μmol/L GCDCA处理人原代肝细胞时，并未发现肝细胞死亡[5]。因此，BAs的直接毒性可能不是导致肝损伤的主要原因。

在小鼠肝细胞或人肝细胞模型中，100 μmol/L的BAs混合物可导致氧化应激反应，诱导细胞凋亡，因此有学者提出了CLI的“凋亡论”[6]。但这一结论的实验证据主要来源于体外肝细胞实验模型，而且BAs浓度高于100 μmol/L，而在胆汁淤积患者血清中测得的毒性BAs浓度(<30 μmol/L)很少能达到如此高的浓度水平[6]。且在胆管结扎术(bile duct ligation，BDL)模型小鼠血清中毒性BAs的最大浓度，如牛磺石胆酸(tauroclithoholic acid,TLCA 24 nmol/L)、脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA 130 nmol/L)、鹅脱氧胆酸(CDCA 13.8 nmol/L)、GCDCA(27 nmol/L)等仅是体外诱导肝细胞凋亡所需浓度的千分之一。使用病理生理浓度的BAs分别处理人原代肝细胞与小鼠原代肝细胞，以及在BDL小鼠术后6～72 h内，均未检测到凋亡标志物caspase-3的活性，ALT水平也没有增加[7]。总结以上数据可以看到，“凋亡论”也不能合理解释CLI的机制。

2 中性粒细胞介导的炎性反应机制

炎性反应可能是CLI发生的主要原因，近年来的研究多集中在CLI中炎性反应的发生机制。BAs作为促炎介质，能够刺激趋化因子产生，使中性粒细胞向肝脏聚集，并释放蛋白酶、活性氧(reactive oxygen species ,ROS)等物质杀伤肝细胞，通过增加细胞内氧化应激和线粒体功能障碍诱导细胞死亡，并造成肝损伤[6]。

在C57BL/6小鼠行BDL术后6 h，BAs显著上升，坏死区域中性粒细胞开始聚集，与组织损伤的时间起点一致，并在整个疾病过程中持续[7]。骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种趋化因子，被基质金属蛋白酶切割以后趋化能力明显增强。在胆管结扎(bile duct ligation，BDL)小鼠模型术后24 h，肝脏坏死区及其周围有大量中性粒细胞聚集，而Opn敲除小鼠肝脏中只有少量中性粒细胞聚集，但在72 h后，二者肝损伤指标并没有显著差异。因此，OPN介导的中性粒细胞聚集可能在早期胆汁淤积性肝损伤中发挥关键作用[8]。

BDL小鼠模型手术72 h后，OPN的作用逐渐被其他炎性介质所取代，CXC家族趋化因子可能是其中之一。BAs作为促炎信号因子，可以触发肝脏促炎因子的表达，将中性粒细胞聚集到胆管渗漏区域[9]。在Abcb4-/-胆汁淤积小鼠模型中，肝脏中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1/CCL2)、CXC趋化因子配体-1(C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1)和 CXC趋化因子配体-2(C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2)的表达增加，中性粒细胞浸润与转氨酶升高[6]。用病理生理浓度(25 μmol/L)的TCA处理小鼠原代肝细胞、胆管细胞与巨噬细胞后，肝细胞中CCL2、CXCL2表达明显增加，招募中性粒细胞聚集[9]。与对照组相比，Ccl2敲除小鼠在诱导胆汁淤积后，趋化因子CCL2的表达下降，肝损伤指标减低，组织学上也几乎没有坏死区域。由此可见，CXC家族趋化因子介导的中性粒细胞聚积在CLI中也发挥了重要作用。在Tlr9敲除小鼠的BDL模型中，趋化因子CCL2、CXCL2表达减少，因此BAs通过激活TLR依赖的信号通路触发肝细胞表达趋化因子CCL2和CXCL2，从而激发炎性反应[9]。

3 介导CLI炎性反应的信号通路

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)包括c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、P38等通路[10]。BAs对肝细胞的损伤与多条MAPK通路有关，在胆汁淤积早期，ERK1/2被激活，早期生长反应调节因子-1(early growth response factor-1，EGR-1)表达上调，促进炎性反应细胞的聚集与活化，从而导致肝损伤[11]。在BDL模型小鼠中，肝实质细胞中EGR-1水平迅速上调，使用ERK抑制剂预处理后，小鼠肝脏中EGR-1的上调也被抑制。Egr-1敲除小鼠行BDL术后， 趋化因子CXCL2和细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)表达上调均明显减少，中性粒细胞聚集减少，肝损伤减轻。因此，ERK/EGR-1通路在CLI中可能发挥了重要的作用[11]。

CCL2表达上调可能与TLR通路相关，JNK、NF-κB和STAT3均受TLR4调控，且在BAs诱导的胰腺腺泡细胞炎性反应中均被激活[12]。在BDL胆汁淤积模型小鼠中发现，CCL2、CXCL1和CXCL2表达均明显上调，JNK被持续激活，JNK的磷酸化显著增加，而NF-κB影响不大[13]。脂多糖(lipopolysa-charide，LPS)是一种典型的TLR4激活剂，LPS刺激C6星状细胞3 h后，CCL2表达增加25.5倍，JNK磷酸化水平迅速增加。JNK抑制剂SP600125可抑制LPS诱导的CCL2上调，而ERK抑制剂PD98059仅有轻微抑制作用[12]。因此，在LPS诱导CCL2的产生可能主要依赖JNK信号通路。

在BDL胆汁淤积模型小鼠和原发性胆汁淤积性患者中发现，BAs积累导致血清中TNF-α大量表达，可使JNK磷酸化增加。AP-1是c-FOS和c-JUN的异源二聚体，是细胞内重要的转录因子。在α-异硫氰酸萘酯(α-naphthylisothiocyanate，ANIT)诱导的小鼠肝内胆汁淤积模型中发现，c-JUN、c-FOS表达增加，JNK被强烈激活，趋化因子CCL2和 CXCL2的表达显著上调，炎性因子IL-6、IL-10表达显著升高[14]。给予AP-1抑制剂T5224后，趋化因子表达显著下调。由上可见，JNK-AP1-CCL2/CXCL2轴在ANIT诱导的肝损伤模型的炎性反应中发挥了重要作用[14-15]。另一项研究发现，在ANIT 诱导的胆汁淤积性模型小鼠中，JNK和STAT3磷酸化表达比对照组显著增加，并与QPCR测得的其靶基因(JNK/AP-1：c-FOS和c-JUN；STAT3：SOCS3，FGA和FGB)的表达上调一致。由于STAT3是JNK下游的转录因子，JNK/STAT3信号轴的激活可能是肝损伤的主要原因之一[16]。

4 巨噬细胞在CLI中的作用

TGR5(G protein-coupled membrane receptor 5)是一种G蛋白偶联BAs受体(GPBAR1)，在肝实质细胞中不表达，主要在Kupffer细胞、窦内皮细胞、胆管细胞、胆囊上皮细胞和胆囊平滑肌细胞表达[17]。BAs喂养野生型小鼠和Tgr5敲除小鼠3 d后，野生型小鼠肝脏中IL-1β和TNF-α表达显著增加，而Tgr5敲除小鼠肝脏中IL-1β和TNF-α的表达无明显变化，说明BAs激活TGR5可诱导小鼠IL-1β和TNF-α的表达。而NF-κB抑制剂BMS-345541和TGR5激活剂齐墩果酸(oleanolic acid，OA)处理巨噬细胞后的结果发现，TGR5介导细胞因子产生与NF-κB无关，而与JNK的活化相关。因此，Kupffer细胞中的TGR5在CLI中起促进作用，并通过JNK通路促进下游炎细胞因子的产生[18]。

但也有研究表明TGR5可能在梗阻性胆汁淤积症中起保护作用。与TGR5敲除小鼠相比，使用OA激活野生型小鼠TGR5后，Kupffer细胞内cAMP的表达增加[19]。体外实验中OA处理Kupffer细胞后，cAMP表达增加了1.7倍，LPS诱导的IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子表达显著下降，同时巨噬细胞向M2型转变[20]。因此，BAs也有可能通过TGR5-cAMP抑制LPS诱导的炎性因子的表达，从而减轻肝损伤。

5 胆管细胞在CLI中的作用

PBC和PSC是以慢性炎性反应、胆管损伤和最终肝纤维化为特征的胆汁淤积性肝病，其靶点是胆管细胞[21]。许多研究表明细胞衰老是PSC/PBC的固有特征，在PSC/PBC患者肝组织中发现衰老因子如P21、P16的表达上调，在门脉周围肝细胞也有表达[21]。使用转化生长因子β受体阻断剂LY2157299处理胆道疾病小鼠模型实验发现，肝实质的旁分泌细胞发生衰老，进而损害肝实质的再生能力[22]。在氧化应激诱导的胆管细胞衰老模型中，趋化因子CCL2和CX3CL1表达上调，促进RAW264.7巨噬细胞的迁移。因此，衰老的胆管上皮细胞可能通过旁分泌调节胆管周围微环境，并参与胆管的病理过程[23]。三羧酸循环中的异柠檬酸脱氢酶1突变代谢代谢产物2-羟基戊二酸能够诱导胆管发生炎性反应，促进巨噬细胞向M2极化，胆道内炎性细胞浸润，IL-10、IL-12表达增加[24]。另外胆管上皮细胞表达的促生长和趋化蛋白能够招募中性粒细胞，刺激驻留的巨噬细胞和组织补体系统，导致局部组织炎性反应[23]。

6 问题与展望

综上所述，由于BAs代谢的复杂性，传统的治疗通过干预BAs代谢治疗CLI效果并不理想。不同原因引起胆汁淤积的生化本质是相同的，因此介导CLI的炎性反应过程很可能也是相同的；寻找并干预CLI的炎性反应过程预期能够阻断肝损伤，保护肝细胞功能，从而有利于恢复正常的代谢功能。中性粒细胞的聚集介导CLI已基本成为共识，目前多数研究结果支持丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的亚家族在CLI炎性反应过程中发挥重要作用，ERK、STAT3等通路发挥什么样的作用需要更多的数据支撑，而多数研究不支持NF-κB通路对CLI产生关键作用。然而，在炎性反应的上游，系统暴露的胆汁酸和肝细胞内堆积的胆汁酸如何激活炎性反应目前仍然知之甚少，有待进一步发现和确认关键信号传导过程，为开发新的治疗方案提供依据。