国井绵雅酱香不同轮次堆积发酵的细菌群落多样性研究

许 玲，董乔娟，于文娟，于盼盼，姜明慧，白秀彬，赵纪文

（山东扳倒井股份有限公司，山东高青 256300）

酱香型白酒是中国最具有代表性的蒸馏酒，以独特的酿造工艺形成酱香突出、酒体醇厚、空杯留香等独特的风格体系[1]。发酵酒醅中的微生物结构直接决定着酒的产质量与酒体风味。细菌在发酵过程中主要是分泌风味型酶、代谢产生风味物质、调节发酵过程微生态结构等。因此，研究酱香型白酒发酵过程的细菌菌群多样性及其结构对解析酱香型白酒独特风味的形成具有重要意义[2]。

酱香型白酒酿造工艺复杂，高温堆积是酱香型白酒独特而又关键的工艺环节之一。堆积过程是物系、酶系、菌系平衡的过程，有的行业专家称其为“二次制曲”。本研究以国井不同轮次酱香堆积发酵后的酒醅为样本，分析细菌的菌群结构特征，即厌氧发酵的菌系底盘。

1 材料与方法

1.1 试验样品采集

样品采自山东扳倒井股份有限公司7 个不同轮次酱香堆积发酵后的酒醅，采样点如图1 所示，每堆酒醅按照升温情况，在中轴断面分为五个层次，每个层次分别取样，取样时在每个温度层均匀取样，最后将五个层次的样品混合，四分法取样，即可代表本轮次堆积酒醅。每轮次样品采集完后及时将样品转移至-80 ℃冰箱密封保存。

图1 扳倒井大酱堆积发酵酒醅样品采样点

1.2 试验方法

采用高通量测序方法对样品的微生物多样性进行分析。实验操作及数据报告出具由上海生工完成。

2 结果与分析

2.1 不同轮次的细菌群落Alpha多样性

2.1.1 基于可操作分类单元（OTU）聚类分析

利用扩增子测序技术分析国井酱香型白酒7个不同轮次堆积发酵酒醅中的细菌菌群结构多样性及演替规律，共获得1784438 条高质量序列。对不同轮次堆积发酵酒醅样品利用Rarefaction curve进行评估，结果表明，每个样本的序列数均超过了30000，且样本的稀释曲线与Shannon 指数曲线均趋于平坦，充分说明测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数微生物的多样性信息。

2.1.2 多样性分析

Alpha 多样性分析可揭示堆积发酵酒醅中微生物群落的丰富度和多样性。Shannon指数反应微生物群落的物种多样性，Coverage 指数反应微生物群落覆盖度。

图2 不同轮次细菌的稀释曲线

图3 不同轮次细菌的Shannon曲线

由表1 可知，不同轮次堆积酒醅样本共得到OTU 数1410，其中第2 轮次样本中的OTU 数最高（251 个），下沙轮次最低（137 个）。Chao 和Ace 值越高，说明群落越丰富；Shannon 和Simpson 值表示群落多样性，Shannon值越高，说明群落多样性越明显，Simpson 值越高，说明群落多样性越低。第2 轮次样本中的Chao和Ace值最高，下沙轮次最低;第5轮次的Shannon 值最高，第2 轮次的Shannon 值最低。各个样本的覆盖率都在99.90 %以上，说明各样品文库的覆盖率足够大，测序结果可体现堆积酒醅样本细菌群落多样性的真实情况。

表1 不同轮次细菌群落多样性指数

2.2 不同轮次的细菌物种与群落结构分析

采用堆积柱形图直观呈现样本中各细菌的相对丰度。对不同轮次酱香堆积发酵酒醅中细菌的16S rDNA基因V3—V4区序列进行分析，研究其细菌物种和群落结构，图4 为不同轮次堆积发酵酒醅样本在门水平上的细菌群落结构组成。

图4 门水平的主要细菌菌群结构

门水平上7 个轮次堆积酒醅中依次检测出10个、10 个、19 个、12 个、15 个、14 个和19 个细菌门，共32个。

7 个轮次共有的细菌门为Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria和Chloroflexi，各轮次中，这些门的总占比在98 %以上。各轮次优势细菌门为Firmicutes（13.4 %～96.8%）、Proteobacteria（2.7%～75.8%）、Actinobacteria（0.2 %～24.0 %），各轮次中，这些门的总占比在97%以上。其中，Firmicutes在下沙、造沙、一轮、四轮中相对丰度均高于50%，是7 个轮次堆积酒醅样品中平均相对丰度（54.8 %）最高的优势细菌门；Proteobacteria 平均相对丰度（37.9 %）次之，在二轮、三轮、五轮中的相对丰度均高于50 %；Actinobacteria 平均相对丰度为7.36 %，在三轮中的相对丰度为23.96%。

王欢等[4]从酱香白酒机械化酿造1～7 轮次堆积发酵酒醅中检出14 个细菌门类，结果显示，Proteobacteria、Actinobacteria 和Firmicutes 为酒醅样本中的优势菌门；任爱容等从茅台镇主酿区大曲样本中检测出21 个门，优势菌门分别是Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria 和Bacteroidetes；郭敏等[7]对酱香大曲制曲微生态多样性进行了研究，从曲胚中共检出9 个细菌门，优势菌门主要为Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria。此外，Firmicutes 和Proteobacteria也被发现是是酱香及芝麻香型白酒酿造过程中的主要细菌门，说明这2 个菌门种群是中国白酒发酵过程中的关键微生物[4]。

在细菌属水平上，酱香型白酒7 个轮次堆积酒醅中依次检出80个、204个、153个、204个、170、196个和258 个细菌属，共检测出706 个不同的细菌属。相对丰度≥1%的细菌属在7 个轮次中的分布数量依次为5、7、8、8、15、10、13，为各轮次堆积发酵酒醅中的优势细菌属，表征了各酿造轮次堆积发酵酒醅细菌结构的特征。

7 个轮次共有的细菌属为Lactobacillus、Acetobacter、Kroppenstedtia、Bacillus、Weissella、Acinetobacter、Pseudomonas、Pediococcus、Staphylococcus、Thermoactinomyces、Saccharopolyspora，在 各 轮 次中，这些属的总占比为50.1%～98.1%。其中，Lactobacillus（2.0 %～63.7 %）和Acetobacter（1.8 %～58.9%）是7 个轮次中的共有优势细菌属，Lactobacillus在下沙、糙沙、一轮中相对丰度为39.3 %～63.7 %，是7 个轮次样品中平均相对丰度（23.2 %）最高的优势细菌属；Acetobacter平均相对丰度22.1 %次之，在造沙、一轮、二轮、三轮中的相对丰度为15.9 %～58.9 %；Kroppenstedtia（1.5 %～22.6%）、Bacillus（1.2%～13.9%）和Staphylococcus（1.0 %～10.0 %）是至少4 个轮次中的优势细菌属，Kroppenstedtia在四轮中的相对丰度为22.6 %；Bacillus在下沙、四轮、五轮中的相对丰度均大于10 %，Staphylococcus在四轮中的相对丰度为10.0%。另外，Weissella在下沙轮次的相对丰度为33.7 %；Virgibacillus在四轮的相对丰度为29.1 %；Arthrobacters在三轮的相对丰度为17.8%；Acinetobacter在五轮的相对丰度为23.9 %；Pseudomonas在五轮的相对丰度为15.5%；Pediococcus在下沙轮的相对丰度为13.1%。

胡小霞等[5]基于高通量测序发现酱香型白酒堆积发酵过程优势细菌属有Lactobacillus等13 个，其中Lactobacillus、Escherichia-Shigella和Virgibacillus占主导地位；张春林等[6]采用高通量测序技术分析酱香型白酒二轮次堆积发酵酒醅，共检测出125个细菌属，优势细菌包括Bacillus、Lactobacillus、Oceanobacillus、Thermoactinomyces、Virgibacillus、Pediococcus等；郭敏[7]基于高通量测序发现酱香大曲中Kroppenstedtia、Oceanobacillus是其主要菌属。

图5 属水平的主要细菌菌群结构

通过统计分析，发现7 个轮次的共有细菌属总含量在各轮次中占50%以上。由表2 可知，7 个轮次堆积发酵酒醅中的特有优势细菌属为1～7 个属类，第4 轮次堆积发酵酒醅中的特有优势细菌属类最多，为7 类，分别是Tuberibacillus、Cronobacter、Cerasibacillus、Anaerosalibacter、Aeribacillus、Geomicrobium、Caldibacillus，下沙轮次仅有Cellulosimicrobium。

表2 各轮次特有优势细菌属

结论表明，扳倒井各轮次酱香堆积发酵酒醅中的细菌群落在属水平上种类丰富，是酱香白酒复杂风味结构形成的关键所在。各轮次堆积发酵酒醅微生物菌群结构多样性特征明显，且各轮次堆积发酵酒醅的细菌属结构组成特征差异性大于共性，这也是不同酿造轮次的特征所在。

3 结论

对国井不同轮次酱香堆积发酵酒醅中细菌菌群结构多样性及其特征进行了系统研究。从7 个生产轮次的堆积发酵酒醅中共检测出32 个细菌门，706 个细菌属。优势细菌门为Firmicutes、Proteobacteria 和Actinobacteria；优势细菌属为Lactoba-cillus、Acetobacter、Kroppenstedtia和Bacillus。本研究进一步揭示了扳倒井不同轮次酱香堆积发酵酒醅中的细菌菌群结构多样性及特征，为解析扳倒井酱香型白酒堆积发酵酒醅中的细菌菌群结构及酱香型白酒高品质酿造机制提供了一定的科学依据。