基于测量不确定度评定啤酒中双乙酰合格率的研究

郭 胜，闫俊锋，杨 莹，徐 程，李文慧，黄婷婷，介恬静，龚 琛，朱桂生

（1.襄阳市公共检验检测中心，湖北襄阳 441000；2.榆林市食品检验检测中心，陕西榆林 719000）

双乙酰是酵母进行缬氨酸合成代谢过程中产生的中间产物（α-乙酰乳酸）积累并分泌到酵母细胞外，通过氧化脱羧反应而产生[1]，属于啤酒发酵过程中产生的不良风味物质[2]。在啤酒中,双乙酰的风味阈值为0.15 mg/L，饮用双乙酰含量超标的啤酒时会有一种馊饭味，严重影响口感[3]。为保证啤酒的良好风味，双乙酰已成为啤酒的常规检测项目。

测量往往会产生测量不确定度[4-5]，啤酒中双乙酰的测量也不例外。当存在测量不确定度时，真值在一定的置信概率下落在“测量值±测量不确定度”所构成的区间里[6]。当测量值处在容许限附时，真值可能落在限量值内，也可能超出限量值，这时测量值有一定的合格概率，测量结果的符合性判定存在一定的误判概率[7]。CNAS-TRL-010：2019《测量不确定度在符合性判定中的应用》[8]给出了通过测量不确定度评定合格概率的理论以及详细计算步骤。

啤酒国家标准GB/T 4927—2008《啤酒》[9]规定啤酒中双乙酰的检验方法为GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[10]，GB/T 4928—2008[10]中双乙酰的检验采用紫外分光光度法。紫外分光光度法定量分析的常规方法是先绘制标准曲线，将样品吸光值带入标准曲线得到样品浓度。GB/T 4928—2008[10]中双乙酰的测定方法并没有绘制标准曲线，而是直接测定样品吸光值求得的双乙酰含量，在这种情况下如何计算紫外分光光度计引入的不确定度是当前需要解决的问题。目前针对这类测量不确定度评定的研究很少，本次测量不确定度评定对单次测量吸光度得到测量结果的检验具有一定的参考意义。在测量不确定度评定之后，本研究基于测量不确定度计算了啤酒中双乙酰含量的合格概率，并给出了计算指定合格概率下，啤酒中双乙酰的控制方法。本研究对啤酒生产企业控制双乙酰含量具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：啤酒（一级），市售。

试剂：盐酸（分析纯），西陇科学股份有限公司；邻苯二胺（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司。

仪器设备：紫外可见分光光度计（UV2550），日本岛津公司；AG135 电子天平（Max=101 g，d=0.1 mg），METTLER TOLEDO Made in Switzerland。

1.2 实验方法

1.2.1 啤酒中双乙酰的测定方法[10]

安装好双乙酰蒸馏器，将蒸气发生瓶加热至沸腾。通气预热，将25 mL 容量瓶置于冷凝器出口收集馏出液。在100 mL量筒中加入1滴消泡剂，加入未经除气、冷却至5 ℃的啤酒试样100 mL，立即转移至蒸馏器内蒸馏，在3 min内完成样品蒸馏，收集馏出液至25 mL容量瓶中，定容，摇匀。

吸取10 mL 馏出液于2 支25 mL 比色管中，于其中1支比色管中加入邻苯二胺溶液0.5 mL，另1支不加，作为空白。盖塞摇匀，置于暗处反应20 min。于样品管中加4 mol/L 盐酸溶液2 mL，于空白管中加4 mol/L 盐酸溶液2.5 mL，盖塞混匀。用10 mm石英比色皿，在335 nm 下，以空白管做参比，测定试样的吸光度。

1.2.2 啤酒中双乙酰的测量不确定度评定

依据JJF 1059.1—2012[6]评定不确定度。

1.2.3 啤酒中双乙酰的合格概率评定

依据CNAS-TRL-010：2019[8]中的计算公式计算合格概率。

2 结果与分析

2.1 啤酒中双乙酰含量的测量结果

在重复性条件下，对样品进行10 次测量，测量结果分别为0.120 mg/L、0.139 mg/L、0.162 mg/L、0.131 mg/L、0.157 mg/L、0.170 mg/L、0.146 mg/L、0.132 mg/L、0.150 mg/L、0.126 mg/L，测量平均值为0.143 mg/L，吸光度平均值为：0.0597。

2.2 测量不确定度的评定

2.2.1 数学模型的建立

试样中双乙酰含量的数学模型为：

式中：X 为试样中双乙酰的含量(mg/L)；A 为样品吸光度；2.4为吸光度与双乙酰含量的换算系数。

2.2.2 测量不确定度来源分析

分析检验过程和数学模型，试样中双乙酰含量的测量不确定度来源见图1。

图1 啤酒中双乙酰含量的测量不确定度来源

2.2.3 取样体积引入的相对不确定度Urel(V1)

查询JJG 130—2011《工作用玻璃液体温度计》[11]，100 mL 量筒量取5 ℃的酒样时，温度计测量酒样的温度误差为±0.5 ℃；酒样的膨胀系数按照水膨胀系数考虑，为2.1×10-4℃-1；温度波动引入的误差按照均匀分布考虑，包含因子k取。

查询JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》[12]，得到玻璃量器的容量允差。CNAS-GL006：2019《化学分析中不确定度的评估指南》[13]推荐玻璃量器的容量误差概率密度函数采用三角分布,包含因子k取。

记录实验过程中，实验室温度波动为20 ℃±4 ℃。

实验过程中，由玻璃量器容量误差与温度误差引入的相对不确定度见表1。

表1 玻璃量器容量误差与温度误差引入的相对不确定度

由检验过程取样体积引入的不确定度来自（1）100 mL量筒量取100 mL酒样引入的误差；（2）25 mL容量瓶定容体积误差；（3）移液管吸取10 mL 馏出液的体积误差。

取样体积引入的相对不确定度Urel(V1)：

2.2.4 定容体积引入的相对不确定度Urel(V2)

由检验过程可知用于比色的液体总体积（定容体积）引入的不确定度来自（1）移液管吸取10 mL馏出液的体积误差；（2）移液管吸取0.5 mL 邻苯二胺溶液的体积误差；（3）移液管吸取2 mL的4 mol/L盐酸溶液的体积误差。

定容体积引入的相对不确定度urel(V2)：

2.2.5 分光光度计引入的不确定度

朗伯-比尔定律的数学表达式在JJG 178—2007《紫外、可见、近红外分光光度计检定规程》[14]条款“3 概述”中有具体定义，数学表达式为：A1=-lgT；式中：A1为吸光度；T为透射比。

对试样重复测量10 次，10 次测量的平均吸光度为0.0597，代入公式，计算得出透射比T 的平均值为0.8752。分光光度计计量性能级别为Ⅱ级，检定合格，查询JJG 178—2007[14]得知仪器透射比最大误差为±0.5%，误差概率密度函数分布假设为均匀分布，包含因子k取。则由仪器透射比引入的不确定度为u(T)==2.526×10-3。

吸光度的灵敏度系数：

分光光度计误差引入的不确定度分量：

2.2.6 测量重复性引入的不确定度分量[6]

重复性试验的标准偏差：

测量重复性引入的不确定度：

测量重复性引入的相对不确定度：

2.2.7 合成相对标准不确定度

2.2.8 标准不确定度

2.2.9 扩展不确定度和结果表示

在95 %包含概率下，包含因子k=2，扩展不确定度：U＝k×u＝2×0.006＝0.012 mg/L。

双乙酰含量测量结果表示为：X＝(0.143±0.012)mg/L，k＝2。

2.3 计算双乙酰含量的合格概率

查询啤酒国家标准GB/T 4927—2008[9]，得到一级啤酒双乙酰的限量值为≤0.15 mg/L，依据CNAS-TRL-010：2019[8]中的合格概率公式，求得合格概率：

查阅GB 4086.1—1983《统计分布数值表正态分布》[15]标准正态分布表，合格概率Pc=87.9%。

3 结论与讨论

GB/T 4928—2008[10]中双乙酰的测定方法并没有绘制标准曲线而是直接测定样品吸光值求得双乙酰含量，对于其测量不确定度的评定，本研究通过朗伯-比尔定律计算公式解决了这一问题。本次测量不确定度的评定过程对与同类型检验的测量不确定度评定也具有一定参考意义。

本次测量测量值小于限量值，在不考虑测量不确定度时，符合性判定可判定为合格；在考虑测量不确定度时，测量真值在95 %的置信概率下处于区间[0.131,0.155]。同样的样本，经由其他实验室测量或者改变测量条件时，测量值可能超过0.15 mg/L，此时就有可能给出不合格的符合性判断结论。依据上文中计算，啤酒试样中双乙酰合格概率为87.9%，所以有12.1%的概率超过0.15 mg/L。

为便于啤酒生产企业控制双乙酰的含量，以确保在给定的合格概率下符合性判定为合格，给定一个合格概率，计算出双乙酰的控制值是迫切需要关注的问题，接下来展开讨论：

CNAS-TRL-010：2019[8]步骤5.4 指出：在通常情况下选取95 %合格概率下的保护带。查询GB 4086.1—1983[15]中的标准正态分布表，当合格概率大于95%时，函数取值需≥1.65，若测量不确定度按照本次的评定值来考虑，则≥1.65，求得y≤1.49 mg/L。也就是说当双乙酰的测量值≤1.49 mg/L时，双乙酰含量的合格概率≥95%。

对于啤酒或者白酒等产品质量控制中的其他检验项目（如酒精度、原麦汁、总酸、氰化物、甜蜜素、甲醇等），企业可以根据实际工作需要确定其合格概率，参考文中的方法制定控制值。