幽门螺旋杆菌毒力因子 CagA 介导的 PI3K-AKT信号通路活化对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

王丽萍,陈 平,丛春莉,刘彦琦

(内蒙医科大学附属医院 消化内科，内蒙古 呼和浩特010050)

胃癌(gastric carcinoma，GC)是由于体内某种类型的细胞在胃异常增殖而引起的[1]。2018年仅新增病例就超过100万例，预估的死亡人数达到78.3万人[2]。该疾病发展是一个多步骤的过程[3]。目前研究发现，某些辐射、化学物质、细菌或病毒在内的许多因素可直接或间接地影响DNA复制过程发生突变，影响细胞增殖[4-6]。有研究使用肿瘤促进剂发现刺激细胞增殖可增加癌症的发展[7]。许多因素可能在胃癌的发展中起作用，这些因素在研究中被证实是影响胃癌发展的独立因素[8-10],如幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori，H.pylori)感染。在发展中国家，70% 至90% 的人在10岁之前携带幽门螺杆菌[11]，60%胃癌患者感染H.pylori。由于H.pylori感染是慢性活动性胃炎、胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤、消化性溃疡及胃癌发生之间的关系已经得到了证实[12]。WHO在1994年已将H.pylori列为第一类致癌物[13]。

幽门螺旋杆菌毒力因子又称细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin-associated gene A,CagA)，是125kDa-145kDa效应蛋白，表达该蛋白的菌株被认为是高毒力菌株，其中就包括H.pylori。CagA(+)的H.pylori菌株被称为Ⅰ型菌株[14]。目前研究已经明确Ⅰ型菌株的H.pylori引起的胃黏膜损伤、胃部炎症更为严重，且患胃癌的风险更高[15]。当CagA 癌蛋白植入到胃上皮细胞时，会扰乱多种细胞内信号通路，促进宿主细胞的恶性转化。CagA 的致癌活性与促炎症反应之间还存在相互的前馈刺激机制[16]，进一步加剧了胃癌的发展。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)激活导致磷脂酰肌醇依赖性激酶1(phosphatidylinositol kinase1，PDK1)的刺激，这是一种磷酸化和激活蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，又称AKT[17]。AKT 通过磷酸化调节包括增殖和存活在内的多种细胞功能的多个靶点来介导 PI3K 的下游作用。PI3K-AKT 信号在胃癌标本中增加，AKT 磷酸化水平的增加与疾病的晚期相关[18]。虽然，CagA(+)菌株感染增强了细胞增殖和疾病的进展，但其参与过程的确切机制仍有待阐明。因此，本研究探讨CagA是否介导PI3K-AKT信号通路活化从而影响胃癌细胞增殖和凋亡。

1 材料与方法

1.1 胃癌细胞株和CagA(+)Hp菌株

从上海信裕生物工程有限公司购买SGC-7901(人胃癌细胞，ECACC,T-25 Flask)，在10% FBS+1%P/S+RPMI-1640生长培养基中，在95%空气、5% CO2、37℃的培养条件下每隔3天传代1次。

从内蒙古大学附属医院胃癌患者胃黏膜分离培养，鉴定CagA(+)的Hp菌株复苏、传代后接种于改良的布氏肉汤培养基中并在5%O2、85%N2、10%CO2、37℃振荡培养36 h。3 600 r/min离心15 min，上清液用0.22 μm直径微孔滤膜过滤后分装。对照滤液中未接种CagA(+)的Hp菌株。

1.2 试剂

Wortmannin购自 Cell Signaling(Danvers，MA，USA)公司，四甲基偶氮唑蓝(methyhhiazolyltet-razolium，MTT)为武汉博士德生物有限公司。GAPDH购自 Santa Cruz 生物技术公司。端粒酶活性检测试剂盒购自上海科艾博生物有限公司。

1.3 细胞处理和分组

SGC-7901于培养基中培养并传代，至细胞贴壁85%后换成新鲜配置的RPMI-1640培养液，不加任何细菌和抑制剂，收集细胞作为对照组。SGC-7901细胞以5×104/ml接种于96孔板，贴壁后弃培养液加入稀释后的Hp菌液作为Hp组。使用Wortmannin作为PI3K-AKT通路抑制剂，经Wortmannin预处理2 h后同Hp组作相同处理，作为CagA(+)+PI3K抑制剂组。

1.4 MTT 法测定细胞活力

选择对数生长期的细胞，配成2.0×104个/ml单细胞悬液后接种在96孔板内，每孔加入200 μl悬液培养24 h。按CagA(+)组和CagA(+)+Wortmannin组分别加入含Hp和/或不和Wortmannin的培养液(DMSO≤0．05%)再温育24、48、72、96 h。以上所有孔设置5个复孔。再加入浓度为5 g/L的MTT10 μl，于37℃孵育4 h后离心弃上清，每孔加入150 μl的DMSO振荡10 min后，用酶标仪检测490 nm处各孔的吸光度值，并重复3次。

1.5 FCM法检测细胞周期及细胞凋亡

各组细胞经不同处理后用0.25%胰酶消化收集，使用 PBS 洗涤2次，并在4℃下在75%乙醇中固定过夜。在 PBS 中洗涤2次后，将细胞用含有10 mg/mL RNA 酶的50 μg/mL(pH7.0)碘化丙锭溶液(R40432，Sigma)染色，并37 ℃孵育，避光30 min。然后将细胞转移到带有过滤器的流式细胞仪管中进行细胞周期分析。

1.6 端粒酶活性检测

根据试剂盒说明书操作，使用基于聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)的银染分析试剂盒(# NKJ15DLM)分析端粒酶活性。在所提供的裂解试剂中提取各组胃癌细胞并提取端粒酶。然后用进行端粒重复扩增法(telomerase repeat amplification protocol，TRAP)。扩增后，PCR 产物在12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离并真空转移到 PAGE 膜上进行银染。在 Bioshine GelX 1650凝胶成像分析系统中扫描端粒酶特异性6-bp 阶梯。用积分光密度法分析该组端粒酶活性。

1.7 PI3K-AKT mRNA相对表达量检测

收集培养细胞，调节细胞浓度为5×106至1×107。用Trizol 试剂(Invitrogen，卡尔斯巴德，CA)从细胞中提取总RNA。Applied Biosystems使用SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，Japan)进行定量实时 PCR 分析。以 GAPDH 的 mRNA 作为内参。PI3K、AKT引物参考文献[19]。用2-ΔΔCt 法计算 PI3K和AKT的相对表达。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 MTT检测

结合细胞吸光度值和细胞个数的观察结果显示，与对照组相比，CagA对胃癌细胞有明显的促进增殖的作用，其增殖作用随时间延长逐渐增强(P<0.05)。经Wortmannin预处理的胃癌细胞活力有所下降，说明CagA可以介导PI3K-AKT活化对胃癌细胞起促进增殖作用(P<0.05)，见图1。

图1 MTT 法测定细胞增殖百分比

2.2 FCM检测

实验结果显示，与对照组相比，CagA对胃癌细胞的有抑制凋亡有作用，该组S期、G2/M期的比例增加(P<0.05)，且未见明显凋亡峰。CagA对胃癌细胞的作用，在PI3K-AKT通路抑制后效应减弱(P<0.05)，见表1。

表1 CagA介导PI3K/AKT活化对胃癌细胞周期的影响(n=15)

2.3 端粒酶活性检测

对比对照组，CagA(+)组的胃癌细胞端粒酶活性较高(P<0.05)，24、48、72、96 h的A值为1.739±0.047、1.832±0.074、2.018±0.063、2.132±0.037。加入Wortmannin预处理后，随着时间延长A值所逐渐降低的趋势(P<0.05)，24、48、72、96 h的A值为0.192±0.002、0.082±0.003、0.073±0.005、0.062±0.003。

2.4 PI3K/AKT mRNA相对表达量检测

用2-ΔΔCt 法计算 PI3K和AKT的相对表达结果显示，与对照组相比，经CagA(+)Hp细菌滤液共孵育的胃癌细胞的PI3K-AKT相对表达量增加(P<0.05)，在加入PI3K-AKT通路抑制剂后，PI3K-AKT相对表达量减少(P<0.05)。说明Wortmannin有起到抑制PI3K-AKT通路的作用，见图2。

图2 各组PI3K/AKT mRNA的相对表达量

*P<0.05

3 讨论

胃癌的发生、发展和侵袭是一个复杂而持续的过程。大多数H.pylori感染者没有症状。只有10% 的感染者患有胃炎和其他疾病。然而，越来越多的证据表明由H.pylori感染引起的疾病确实增加了患胃癌的风险，即幽门螺杆菌与胃癌确有因果关系存在。有报道总结了所有可用的病例对照研究，并得出结论:幽门螺杆菌感染患者发生胃癌的相对风险是无感染患者的3.8倍。此外，在确诊为幽门螺杆菌感染15年后，这种风险增加到8.7倍[20]。虽然H.pylori被认为是一类致癌物质，但它可能不是一种直接的诱变剂。CagA 及其相关致病岛(CagPAI)与癌症风险增加有关。CagA阳性被认为是幽门螺杆菌毒力的可能决定因素。研究表明，CagA 阳性H.pylori感染对胃癌的发生和发展有重要影响。CagA通过上皮细胞释放白细胞介素8引起炎症反应增加，导致活动性炎症[21]。有研究发现，CagA 状态和胃蛋白酶原水平之间有很强的相关性[22]。CagA 通过由 CagPAI 编码的Ⅳ型分泌系统转运到宿主细胞，定位于质膜，酪氨酸被多种 Src 激酶磷酸化。酪氨酸磷酸化的 CagA 激活 SHP-2，促进细胞增殖。

PI3K 通路是细胞中最重要的信号通路之一，参与了许多基本的细胞过程，包括增殖、细胞存活、运动和细胞生长[23],也是细胞应激过程中存活的关键调节因子[24]。PI3K-AKT通路的激活导致对肿瘤细胞生长和存活调控的严重干扰，最终导致竞争性生长优势，转移能力，血管生成和治疗抵抗，因此PI3K-AKT通路活化对胃癌的发生发展产生很大的影响。该通路也被认为是抗癌药物开发的最有潜力的通路之一。

在本研究中发现CagA(+)Hp感染的胃癌细胞增殖增加、凋亡降低、端粒酶活性升高，这些表现在PI3K-AKT通路被抑制后被降低。提示PI3K-AKT可能与CagA发生相互作用，影响胃癌的发生发展，可能PI3K是CagA在胃癌细胞中的靶分子。研究还表明CagA 和 PI3K-AKT可以通过影响细胞周期来促进细胞增殖，在PI3K-AKT通路被抑制后，CagA对细胞周期的调节作用减弱。这些结果表明PI3K-AKT可能是CagA调节细胞周期的靶点。