细胞外组蛋白在小鼠放射性心脏损伤中的意义

刘立杰，闫佳旭，白立立，张小陆，霍新龙，于晓麟，顾 涛，张 双，贾洪菊，华海侠

(秦皇岛市第一医院，河北 秦皇岛066000)

胸部恶性肿瘤发病率逐年升高，放射治疗是胸部恶性肿瘤的主要治疗手段之一。虽然放射治疗技术在逐渐改进，但仍避免不了心脏及邻近器官受到照射[1-2]。研究发现，放射性心脏损伤(RIHD)是非癌症相关死亡率的主要原因之一[3]。RIHD可以降低心肌收缩和舒张功能，最终导致心肌电生理障碍、心律失常、心力衰竭甚至猝死[4-6]。目前RIHD病因机制尚不明确，但越来越多证据说明放疗中、放疗后会存在急性炎症反应，受损的内皮细胞分泌黏附分子和生长因子，继而促进肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6) 的分泌，促进炎症反应和心肌纤维化[7-9]。因此如能针对性的进行抗炎治疗，可能是预防甚至逆转RIHD的有效措施[10]。细胞外组蛋白是一种促炎介质，在启动和加重炎性损伤中起重要作用。本研究通过建立RIHD小鼠模型，外源性给予肝素进行干预，观察其对RIHD是否有保护作用，并分析其作用机制与细胞外组蛋白的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物及分组 将60只雄性C57BL/6小鼠随机分为3组：对照组、单纯放射组、肝素联合放射组，每组照射前、1 w、2 w、4 w、8 w 5个时间点各4只小鼠用于试验。

1.1.2主要仪器及试剂 Trilogy H295795直线加速器、电热恒温鼓风干燥箱DGG-1940A型、SpectraMax 190全波长酶标仪、Biofuge Stratos全能台式高速冷冻离心机、0.9%生理盐水、PBS缓冲液、HE染色试剂、二甲苯、福尔马林溶液、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、石蜡、苏木素、盐酸酒精、伊红、中性树胶等、Masson三色染色试剂盒、MPO ELISA试剂盒、细胞外组蛋白ELISA测定试剂盒、Luminex检测系列细胞因子试剂盒、肝素钠注射液。

1.2 方法

1.2.1实施方法 对照组只麻醉不放射；单纯放射组、肝素联合放射组分别给予6 MV-X线20Gy单次照射小鼠心脏；肝素联合放射组在放射后每周同时间给予皮下注射肝素300 U/kg进行干预； 对照组与单纯放射组每周同时间点给予腹腔内注射等体积质量分数为0.9%的氯化钠溶液。分别于放射后0、1、2、4、8周摘小鼠眼球取血，并取小鼠心脏组织进行检测，观察病理变化、血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)水平、心肌组织髓过氧化物酶(MPO)水平、血浆细胞外组蛋白水平，转化生长因子-β1(TGF-β1)以及血浆炎症因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的动态变化。

1.2.2病理学观察 采用苏木精-伊红(HE)染色法、Masson染色法观察心脏病理损伤，并通过Masson染色定量测量心肌胶原容积分数(CVF)：CVF=视野中胶原纤维面积/视野总面积，求平均值进行定量分析。

1.2.3血清cTnI、CK-MB检测 检测前将冻存血浆复融，轻缓充分混匀，2 000 r/min离心15 min后取上清液，严格按试剂盒使用说明书操作。

1.2.4心脏组织标志物检测 取冻存心脏组织严格按MPO试剂盒说明书步骤操作监测MPO水平。

1.2.5血浆细胞外组蛋白及细胞因子检测 取冻存小鼠血浆严格按试剂盒说明书步骤操作。用ELISA法检测小鼠血浆细胞外组蛋白水平，应用液相芯片分析系统(Luminex法)检测小鼠TGF-β1、血浆炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平的动态变化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组小鼠造模及干预后HE染色心肌组织病理变化

HE染色放射后单纯放射组、肝素联合放射组小鼠1、2周心肌病理变化不显著,放射后4、8周后心脏间质中可见中性粒细胞、淋巴细胞数量增多，心肌细胞排列略微散乱，间质增宽。其中肝素联合放射组小鼠较单纯放射组心脏损伤的病理改变明显好转，炎细胞浸润减轻，但仍较对照组小鼠高，见图1。

图1 各组小鼠HE染色显微镜检结果(×200)

2.2 各组小鼠放射损伤干预后Masson染色心肌组织病理变化

Masson染色放射后单纯放射组、肝素联合放射组小鼠1、2周心肌病理变化不著，放射后4、8周可见心肌细胞排列紊乱，心肌细胞间质、血管周围蓝染的胶原纤维沉积较对照组明显增多，其中肝素联合放射组小鼠上述病理改变明显好转，胶原纤维沉积减少，纤维化程度减弱，但仍较对照组小鼠变化显著，见图2。

图2 各组小鼠Masson染色显微镜检结果

2.3 各组小鼠放射损伤干预后心肌胶原容积分数(CVF)评估

定量分析各组小鼠心肌胶原容积分数(CVF)，各组小鼠CVF在放射后1、2周时无明显变化，P>0.05。

单纯放射组及肝素联合放射组放射后4周时达到最大值分别为(11.05%±0.16% vs 7.21%±0.17%)，4周后两组CVF水平减少，但仍高于对照组(P<0.05)，见图3。

图3 各组小鼠不同时间心肌胶原容积分数(CVF)变化情况

2.4 各组小鼠放射损伤干预后血清标志物水平

单纯放射组及肝素联合放射组的cTnI在放射后2周达到最高分别为(500.51±0.78 vs 285.89±0.85)，2周后水平开始下降，肝素联合放射组的cTnI测得值较相应时间单纯放射组降低，仍高于对照组(P<0.05)，见图4。

图4 各组小鼠不同时间cTnI水平变化情况

单纯放射组及肝素联合放射组的CK-MB在放射后1周达到最高分别为(649.12±1.16 vs 289.56±1.66),1周后水平开始下降，肝素联合放射组的CK-MB测得值较相应时间单纯放射组降低，但仍高于对照组(P<0.05)，见图5。

图5 各组小鼠不同时间CK-MB水平变化情况

2.5 各组小鼠放射损伤干预后血浆细胞外组蛋白水平的动态变化

单纯放射组及肝素联合放射组的细胞外组蛋白水平在放射后2周达到最大分别为(0.86±0.23 vs 1.64±0.67)2周后开始下降，肝素联合放射组的测得值较相应时间单纯放射组降低但仍高于对照组(P<0.05)，见图6。

图6 各组小鼠不同时间血浆细胞外组蛋白水平变化情况

2.6 各组小鼠放射损伤干预后组织匀浆液MPO水平的动态变化

单纯放射组及肝素联合放射组的组织匀浆液MPO水平在放射后1周达到最大,1周后开始下降，肝素联合放射组的测得值较相应时间单纯放射组降低，仍高于对照组(P<0.05)，见图7。

图7 各组小鼠不同时间MPO水平变化情况

2.7 各组小鼠放射损伤干预后血浆TGF-β1水平的动态变化

单纯放射组及肝素联合放射组的血浆TGF-β1水平在放射后4周达到最大,分别为(26.76±0.72 vs 22.67±0.13)，4周后开始下降，肝素联合放射组的测得值较相应时间单纯放射组降低，仍高于对照组(P<0.05)，见图8。

图8 各组小鼠不同时间血浆TGF-β1水平变化情况

2.8 各组小鼠放射损伤干预后血浆IL-1β、IL-6、TN F-α水平的动态变化

与单纯放射组相比，肝素联合放射组的血浆IL-1β、IL-6、TNF-α水平在各时间点水平均明显下降，与对照组小鼠同时间点水平有明显统计学差异(P<0.05)，见图9-11。

图9 各组小鼠不同时间血浆IL-1β水平变化情况

图10 各组小鼠不同时间血浆IL-6水平变化情况

图11 各组小鼠不同时间血浆TNF-α水平变化情况

3 讨论

RIHD是胸部肿瘤放疗中一种常见的并发症[1，11]，可以导致心肌电生理障碍、心律失常、心力衰竭甚至猝死[4-6]，严重影响患者的生活质量。但是目前关于RIHD的发病机制尚未完全阐明。有研究表明，RIHD的发生是炎症和纤维化途径相互作用的结果[12]，其早期会出现炎症反应，中性粒细胞被募集激活，释放大量MPO、炎性细胞因子如TNF和白细胞介素(IL-1、IL-6和IL-8)，随着照射次数的增加，巨噬细胞分泌转化生长因子TGF-β，其负责成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，最终引起心肌纤维化，导致RIHD的发生。本研究中各组小鼠在照射前期(1、2周)后血清CK-MB、cTnI水平、组织匀浆液MPO水平、血浆炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平升高，照射后期(4周)后出现了典型的心脏损伤纤维化的病理学表现，同时血浆TGF-β1水平在放射后4周达到最大，其变化规律与心肌胶原容积分数CVF趋势一致，说明TGF-β表达的升高促进了胶原合成和沉积，是形成RIHD晚期心肌纤维化的重要环节。证实了RIHD的发生是早期炎症反应和晚期心肌纤维化相互作用的结果。因此抗炎治疗、通过抗炎逆转纤维化的药物干预是RIHD预防甚至逆转RIHD的有效措施[13-14]。

大量研究表明，细胞外组蛋白具有促炎作用，它作为损伤相关分子模式(DAMP) 分子的新成员，在激活免疫及炎症反应，启动或加重组织损伤等方面发挥重要作用。有多项研究已经探讨了细胞外组蛋白在急性肝衰竭、急性缺血性肾损伤、放射性肺损伤、脓毒血症等疾病中的作用[15-18]。这些研究均显示，细胞外组蛋白能介导炎性损伤反应，参与多种疾病的发生发展。本研究结果显示细胞外组蛋白和血清中cTnI、CK-MB、血浆炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)都在1周后开始升高，提示细胞外组蛋白可能在RIHD的早期启动阶段发挥促炎作用。因此探索中和或降解细胞外组蛋白的有效药物是当前的研究热点[19]。肝素是一种高度硫酸化的蛋白聚糖，是临床常用的强效抗凝剂，但也有重要的抗炎作用[20]。温韬等人[21]研究报道说明肝素能有效结合并降低血浆中的细胞外组蛋白水平。本课题组的前期研究也说明了细胞外组蛋白在肝癌射频消融术后、放射性肺损伤中的作用，体外和体内模型中也研究了组蛋白诱导的细胞毒性和肝素的保护作用的基本机制[22-24]。本研究结果显示与单纯放射组相比，肝素联合放射组小鼠心脏损伤的病理表现明显好转，炎细胞浸润减少，胶原纤维沉积减弱，CVF下降，血清中cTnI、CK-MB、细胞外组蛋白水平、血浆炎症因子测得值均明显下降，其中细胞外组蛋白及炎症因子水平在放射1、2周后下降更为明显，推测肝素可能中和了细胞外组蛋白从而减轻了炎症反应，对炎症具有抑制作用。

总之，本次研究通过建立放射性心脏损伤小鼠模型，外源性给予肝素进行干预，分析肝素干预前后细胞外组蛋白水平变化，探索了其在小鼠放射性心脏损伤中的意义。