血浆外泌体miR-21对胃癌细胞药物敏感性的影响

杜 沛，李 婷，文 雯

(空军军医大学第一附属医院 胃肠外科，陕西 西安771032)

奥沙利铂是胃癌主要的化疗药物之一，通过干扰肿瘤细胞DNA复制从而诱导其凋亡，同时还能影响机体的免疫功能，而患者在化疗过程中产生的耐药性是治疗失败的主要原因。若能在化疗前得知患者的耐药情况，及早使用靶向药物，对于控制患者病情和提高患者的生存期具有重要意义。外泌体是由细胞主动分泌的，由蛋白质、核酸、抗原、脂类和糖类等组成的纳米级囊泡小体，可携带宿主细胞的miRNAs、蛋白、抗原等进入不同的受体细胞，发挥功能[1]。研究表明，外泌体包含很多与耐药性相关的miRNAs，例如miR-21[2]，miR-206[3]，miR-27a[4]等，但外泌体来源的miRNA能够在胃癌中传递耐药性却罕见报道。本研究通过研究外泌体来源的miR-21在胃癌细胞中传递耐药性的功能，为胃癌患者化疗前的药效评价提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料人胃癌细胞SGC7901购于上海中科院细胞库；RPMI-1640培养基、标准胎牛血清、双抗(青霉素、链霉素)、胰蛋白酶、Cell Counting Kit-8(CCK8)细胞计数试剂盒均购于北京Solarbio科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光底物购于武汉艾迪康生物科技有限公司；CD9、TSG101、CD63一抗、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗均购于武汉爱博泰克生物科技有限公司；RNA提取试剂盒、miRNA逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒购于日本Takara公司；双荧光素报告酶试剂盒购于美国Promega公司。MK3型酶标仪、CO2细胞培养箱购于美国Thermo Forma公司，DYY-8C型电泳仪稳压电源、SDS-PAGE蛋白电泳仪、转膜仪购于北京六一仪器厂，Step one plus实时荧光定量PCR仪购于美国ABI公司，CKX41型倒置相差显微镜购自于日本Olympus公司，超净工作台购自于苏净集团安泰公司，5810R型冷冻离心机购于德国Eppendorf公司。

1.2 细胞培养以及耐药细胞构建

为建立奥沙利铂耐药细胞系SGC7901/L-OHP，将SGC7901细胞采用逐步增加奥沙利铂浓度梯度进行诱导。SGC7901和SGC7901/L-OHP细胞的培养于RPMI1640培养基，培养基中包含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，5%的二氧化碳，培养箱的温度为37℃。

1.3 细胞活力检测

CCK8测定奥沙利铂对敏感细胞SGC7901和耐药细胞SGC7901/L-OHP生长活力的影响。加入RPMI1640完全培养基制备单细胞悬液，按照5×103细胞/mL接种到96孔板中，然后在培养箱中进行过夜孵育。随后加入不同浓度的奥沙利铂，孵育24 h。向每个96孔板加入10 μl新鲜制备的CCK-8溶液，在37°C孵育4 h。利用多功能酶标仪在450 nm的激发波长下测量OD值，X轴上绘制奥沙利铂浓度，在Y轴上绘制OD450值，绘制细胞生长曲线，计算奥沙利铂引起细胞的半抑制浓度(IC50)，所有实验分别进行了3次。

1.4 外泌体的提取分离和形态鉴定

收集细胞培养上清，12 000 g离心30 min，去除上清，得到外泌体。向外泌体中加入5 ml PBS，对外泌体进行洗涤，轻轻混匀后使用离心力12 000 g离心30 min，去除上清，得到洗涤后的外泌体。从-80℃冰箱取出分装后的外泌体，取10 μl外泌体悬液滴至2 mm电镜铜网状栅中，室温静止1 min，用滤纸吸去多余水分。加入10 μl、20 g/L磷钨酸于铜网上负染 2 min 后滤纸吸干，白炽灯下烤干，采用 Hitachi-7500 透射电子显微镜观察外泌体形态并拍照。

1.5 蛋白质免疫印迹

取出分装后的外泌体，加入适量蛋白裂解液冰上裂解30 min，每隔5 min于涡旋仪上震荡，4℃下12 000离心10 min，上清即为外泌体蛋白。蛋白样本进行10% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，待Marker完全分离，将胶转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭90 min。采用含1% Tween-20的TBS洗膜，每次5 min，共3次。分别加入一抗(1∶1 000)于4℃孵育过夜，二抗(1∶10 000)37 ℃孵育1.5 h，凝胶成像仪捕获蛋白条带图像，采用Image J软件进行量化，实验重复3次。

1.6 SGC7901/L-OHP细胞来源外泌体与SGC7901细胞共培养

向耐药细胞株SGC7901/L-OHP中转染miR-21 mimic，继续培养细胞48 h。收集细胞培养上清，采用超速离心法分离外泌体。将SGC7901/L-OHP细胞中分离的外泌体与敏感细胞SGC7901共培养，随后采用奥沙利铂处理，观察奥沙利铂对SGC7901增殖抑制率的影响。

1.7 荧光定量PCR

根据说明书要求，使用TRIzol试剂从细胞、外泌体和临床组织样本中提取出总RNA，并用 Prime Script RT reagent Kit(Invitrogen,USA) 合成第一链cDNA。使用miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit(TIANGEN)进行RT-qPCR反应。miRNA的相对表达水平用U6进行标准化。相对表达量用2-ΔΔCT法进行计算。

1.8 患者纳入和排除标准

选择 2018年1月至 2021年6月就诊于空军军医大学第一附属医院的124例患者，其中治疗敏感患者62例，耐药患者62例，行腹腔镜胃癌根治术并接受术后铂类化疗的。纳入标准：签署知情同意书，同意参加此研究者；年龄 18～75岁；病理确诊进展期胃癌患者；患者均进行规范腹腔镜胃癌根治手术，并接受了以铂类为基础的化疗方案；既往无其他部位肿瘤病史；无严重心肺功能、肝肾功能损害等化疗禁忌者。排除标准：后期无法实现随访者；妊娠或哺乳期妇女；临床资料不全者；血液系统及免疫系统疾病患者。

1.9 数据统计分析

采用Graphpad prism 8.0.3软件对数据进行统计分析，数据用均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体形态和标志物鉴定如图1所示，透射电镜下可见大小不一、外形为椭圆形微小囊状，此为外泌体。随后用western blot检测外泌体标志蛋白，结果显示，在血浆和血浆外泌体中均能检测到外泌体标志蛋白TSG101、CD63和CD9的表达，与血浆相比，血浆外泌体中TSG101、CD63 及 CD9 的蛋白表达量更高，见图2。

图1 透射电镜观察外泌体形态量

图2 Western blot检测外泌体标记蛋白CD9、CD63和TSG101的表达

2.2 RT-qPCR检测外泌体miR-21在耐药细胞SGC7901/L-OHP和亲本细胞SGC7901中的表达量结果显示，miR-21在耐药细胞株SGC7901/L-OHP中的相对表达量高于SGC7901中的相对表达量，其中在SGC7901/L-OHP细胞株中的相对表达量为7.703±2.142，在SGC7901中的相对表达量为0.937±0.071(P<0.05)。

2.3 外泌体miR-21传递耐药性的能力检测向SGC7901/L-OHP中转入miR-21 mimic和NC mimic，检测miR-21的过表达效率，结果显示，miR-21在SGC7901/L-OHP中的相对表达量为11.69±1.239，在对照组NC mimic中的相对表达量为1.120±0.120，说明miR-21转染成功(P<0.05)。收集转染miR-21 mimic和NC miRNA的SGC7901/L-OHP细胞培养上清，分别提取外泌体，与亲本细胞SGC7901细胞共培养，并设置未共培养的SGC7901作为空白对照组。通过CCK8检测SGC7901对奥沙利铂的敏感性，IC50在空白对照组、NC mimic组和miR-21 mimic组中分别为16.40、22.95和39.46 μmol/L，说明耐药细胞SGC7901/L-OHP通过外泌体将耐药性传递给敏感细胞，使亲本细胞对奥沙利铂的敏感性下降。

2.4 RT-qPCR检测临床血浆样本外泌体中miR-21的表达量患者在诱导化疗结束后，根据疗效将患者分为两组，分别选取化疗敏感者和耐药患者各62例，提取血浆外泌体，检测患者miR-21的表达量，结果显示，化疗敏感患者血浆外泌体中的相对表达量为2.235±1.491，耐药患者血浆外泌体中的相对表达量为7.682±4.490。说明，miR-21在耐药患者血浆外泌体中的表达量高于敏感患者的血浆外泌体(P<0.05)。

2.5 血浆外泌体miR-21对胃癌患者化疗敏感性的预测价值ROC曲线结果显示，外泌体miR-21预测胃癌患者化疗敏感性的曲线下面积为0.7921(95%CI:0.7118-0.8725，P<0.001)，灵敏度和特异性分别为62.90%和96.77%，见图3。

图3 ROC曲线显示血浆外泌体miR-21表达对胃癌患者化疗敏感性的预测价值

3 讨论

肿瘤化疗耐药是一个复杂多因子参与的一个过程，耐药发生的原因主要包括药物外流、细胞凋亡减少、DNA修复能力增强等。化疗耐药是导致患者治疗失败的主要原因，若是在化疗前得知患者对药物的敏感性，及早使用靶向药物，对于控制患者病情，提高患者的生存期具有重要意义。

外泌体是直径在30～150 nm之间的囊泡，广泛存在于多种体液中，富含有多种生物活性成分，具有显著的分子异质性。外泌体作为一种重要的细胞间信息交流的工具，是连接细胞与微环境之间相互作用的桥梁。外泌体包裹miRNA可以防止被RNAase酶降解，有利于被受体细胞摄取进而影响受体细胞的生物学行为。耐药细胞可以将携带miRNA的外泌体释放到微环境中，进而赋予受体细胞耐药性[1]。经研究证实，肿瘤细胞分泌的外泌体不但可以促进肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移，抑制机体的免疫反应，同时，耐药细胞来源的外泌体能将分子转运至受体细胞，增加受体细胞对化疗药物的耐药性。

文献调研发现miR-21能够通过外泌体分泌，促进结肠腺癌的增殖、侵袭和耐药[5]；同时外泌体来源的miR-21还能增加食管癌[6]和肺癌[7]等肿瘤的化疗耐药性；另外，外泌体来源的miR-21还能通过靶向PTEN和PDCD4促进口腔鳞癌的耐药性[8]。miR-21能否通过外泌体将miR-21从耐药细胞传递到受体细胞？迄今为止，仅有研究表明巨噬细胞外泌体来源的miR-21能够增加胃癌细胞的耐药性[9]，但是miR-21在胃癌中从耐药细胞传递到敏感细胞未曾见报道。

因此，本研究用胃癌细胞SGC7901构建了奥沙利铂耐药细胞株，并提取耐药细胞和敏感细胞上清的外泌体，检测外泌体的形态和标记蛋白，随后，检测耐药细胞和敏感细胞株中miR-21的表达量，发现miR-21在奥沙利铂耐药细胞中的表达量高于敏感细胞，这与miR-21在上述文献中的作用一致。随后向耐药细胞中转染miR-21后，收集上清提取外泌体并添加至敏感细胞中，结果显示敏感细胞的IC50增加，最后，收集了临床上化疗敏感和耐药的患者血浆，发现对化疗药物不敏感患者中的miR-21相对表达量较化疗敏感者高，且ROC曲线分析显示血浆外泌体miR-21能够作为胃癌评价化疗耐药的标志物。

肿瘤化疗耐药是一个复杂多因子参与的一个过程，外泌体介导的耐药因子还有很多。在本研究中，只探讨了一种胃癌耐药细胞SGC7901/L-OHP，在其他胃癌细胞中，是否也存在同样的耐药情况，还需要进一步去探索，另外miR-21是否只能对奥沙利铂作用胃癌的疗效进行预测？在其他化疗药物中的疗效怎样也将是后续需要探索的问题。