胃癌患者血清sB7-H3检测的临床意义

陈 忠，朱 燕，毛 飞

(1.合肥京东方医院 检验科，安徽 合肥230012；2.江苏大学附属人民医院 检验科，江苏 镇江212002；3.江苏大学 医学院，江苏 镇江212013)

胃癌的诊断和治疗策略的改进可以提高胃癌的早期发现率，从而可以降低患者死亡率。然而，尽管新的抗肿瘤药物能够改善胃癌患者的预后，但总体生存率仍不理想[1]。因此，寻求新的肿瘤分子标志物以提高对肿瘤早期发生进展侵袭转移的预测，具有重要的临床应用价值。B7-H3(CD276)是B7/CD28家族重要的免疫检查点成员。许多B7分子与CTLA4、PD-1等已知检查点标记相互作用，被认为能共同刺激免疫应答[2]。最近有研究发现它在抗原呈递细胞上诱导抑制T细胞功能发挥重要作用，有助于肿瘤细胞的免疫逃避[3]。B7-H3在多种人类实体瘤中高表达，尽管它的受体还没有被确定，但其影响肿瘤进展已经超出它的免疫调节作用。血清sB7-H3(soluble B7-H3)作为非侵入性检测指标用于肝癌、大肠癌及胆囊癌等疾病的检测已有报道[4-6]。但检测其在胃癌患者血清中含量与胃癌临床病理特征相关性的研究罕见，本研究旨在探讨检测血清sB7-H4在胃癌诊疗中的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源及临床资料

随机选取2020年7月-2021年6月在江苏大学附属人民医院普通外科接受根治手术的60例胃癌患者的胃癌及癌旁组织(距肿瘤病灶外5 cm)样本，术前有化放疗史均已排除，采集上述胃癌组术前及40例慢性胃炎组的外周血3 ml，所有病例均经病理确诊，并收集30例健康志愿者的外周血3 ml做对照组。其中胃癌组：男(34例)，女(26例)，年龄35岁-82岁，中位年龄59岁。均预先告知所有患者及家属并签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂

酶标仪(瑞士 Tecan公司)、B7-H3检测ELISA盒(上海凯博生物科技公司)、小鼠抗人B7-H3单克隆抗体(苏州大学医学生物技术研究所)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG(北京中杉金桥技术有限公司)、IHC染色试剂盒(武汉博士德公司)。

1.3 方法

1.3.1ELISA 采集各受试者空腹外周静脉血3 ml，以2 000 r/min 离心5 min，分离血清存于-80℃冰箱待检。严格按试剂盒操作说明书要求用ELISA方法检测血清sB7-H3水平，读取酶标仪450/540 nm处吸光度(A)值，根据标准曲线计算样品的浓度值(ng/ml)。

1.3.2免疫组织化学 对石蜡包埋的组织块进行3 μm组织切片，然后用二甲苯脱蜡和梯度酒精洗涤水化，在柠檬酸缓冲液中微波提取抗原。切片用无血清蛋白阻滞剂封闭10 min修复抗原，按IHC染色试剂盒说明书进行操作，加入小鼠抗人B7-H3单克隆抗体(1/200稀释)，一抗孵育后，3次PBS洗涤，用二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(1/3000稀释)孵育15 min，阴性对照组织切片不加一抗。免疫组化染色评分是按照Fromovitz方法判定[7]，按照切片中着色阳性肿瘤细胞所占百分比与着色强度的乘积进行判定，肿瘤细胞着色阳性比例：≤10% 1分；11%～50% 2分；51%～75% 3分；>75% 4分；另以着色强度分为：无 0分；浅黄色1分；棕黄色2分；棕褐色3分。最终染色评分为二者的乘积，评分≥3分为B7-H3蛋白阳性表达。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 各组血清sB7-H3水平比较

胃癌组血清sB7-H3浓度为(25.5±11.4)ng/ml，显著高于慢性胃炎组(9.1±7.8)ng/ml和健康志愿对照组(7.8±6.5)ng/ml，差异均有统计学意义(P<0.0001)，见图1。

图1 各组血清sB7-H3水平比较

2.2 胃癌及癌旁组织中B7-H3蛋白表达

IHC染色结果显示，60例胃癌组织中，有46例B7-H3蛋白呈阳性表达，其阳性表达率为 76.7%(46/60)，而其对应癌旁组织的阳性表达率为8.3%(5/60)，差异均有统计学意义(P<0.05)，主要在细胞膜和细胞质中，见图2。

注：A为胃癌旁组织细胞膜、细胞质不表达B7-H3蛋白；B为胃癌组织细胞膜、细胞质B7-H3蛋白阳性表达

2.3 胃癌组血清sB7-H3水平在临床病理因素及癌组织表达各组间的统计学分析

胃癌组血清sB7-H3水平在肿瘤分化程度、TNM分期、浸润深度、B7-H3蛋白表达及有无远处转移各组间差异均有统计学意义(P<0.05)，而在胃癌患者各组间性别、年龄、肿瘤大小的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 胃癌组血清sB7-H3水平在临床病理因素及癌组织表达情况各组间的统计学分析

3 讨论

B7-H3是B7配体家族的一员，是一种在抗原提呈细胞上表达的外周膜蛋白，也是适应性免疫反应的重要调节因子。是基于抗体肿瘤免疫治疗中一个有吸引力的靶点，它在分化的恶性细胞和癌源性细胞上过表达，在多种实体瘤中表达阳性。但在正常组织中有少量低水平表达。在非恶性组织中，B7-H3在适应性免疫中具有主要的抑制作用，抑制T细胞的活化和增殖。在恶性组织中，B7-H3抑制肿瘤抗原特异性免疫反应，导致原癌形成[8]。B7-H3在肿瘤/上皮细胞和免疫细胞中表达，包括巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和骨髓来源的抑制细胞，B7-H3在肿瘤细胞中的表达水平高于非肿瘤组织细胞[9]。B7-H3除了具有免疫调节作用外，还具有内在的促肿瘤活性，与促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、血管生成、转移和抗癌耐药有关，参与肿瘤免疫原性和癌症进展[10]。B7-H3可能作为循环可溶性亚型存在于血清和其他体液中，它在多种肿瘤中过表达，与肿瘤预后不良相关。B7-H3蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)和前列腺癌等多种肿瘤组织中均有表达[9,11]，NSCLC中B7-H3过表达与肿瘤浸润性细胞毒淋巴细胞增多和预后不良相关。食管癌组织中B7-H3的高表达与肿瘤侵袭和生存时间显著相关，B7-H3的高表达参与了食管癌进展，可能参与了T细胞介导的肿瘤微环境抗肿瘤反应的负调控以及食管癌细胞的增殖和迁移[12]。结直肠癌组织中B7-H3表达与巨噬细胞浸润密度呈正相关，B7-H3表达及巨噬细胞浸润密度与患者总体生存率呈负相关，B7-H3通过STAT3信号通路调控结直肠癌细胞中CDC25A的表达。此外，过表达B7-H3通过降低CDC25A依赖的G2/M期阻滞而增强了化疗耐药性。与正常邻近组织相比，结直肠癌样本中B7-H3和CDC25A均显著上调，且水平与肿瘤分期相关，CDC25A与B7-H3表达呈正相关[13]。B7-H3的表达与许多临床病理特征相关，包括肿瘤分期、浸润深度、淋巴结受累度和生存率[14]。乳腺癌组织中B7-H3 mRNA及蛋白表达水平显著高于癌旁组织，B7-H3可能成为乳腺癌治疗的新靶点[15]。肾癌中发现一组B7-H3表达的CAFs(Cancer-associated fibroblasts)，B7-H3可刺激CAFs分泌HGF和CXCL12，对CAFs有较强的抗凋亡作用，B7-H3+ CAFs可促进肾癌的侵袭和转移[16]。迄今国内外学者对实体瘤组织中B7-H3表达的研究较多，而对外周血中B7-H3表达的研究甚少。宫颈癌患者血清中B7-H3水平明显高于正常献血者，高表达B7-H3可促进宫颈癌细胞增殖，增强了宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力，B7-H3在宫颈癌组织中的表达明显高于正常宫颈组织，B7-H3高表达与宫颈癌患者预后不良有关，它能促进宫颈癌的增殖、侵袭和迁移，可能是治疗宫颈癌的潜在靶点[17]。Lina等[18]研究结果表明慢性胃炎患者B7-H3表达增高与幽门螺旋杆菌相关慢性胃炎患者Th2细胞应答增强有很强的相关性，幽门螺杆菌通过CagA和肽聚糖直接上调B7-H3表达，并通过操纵宿主T细胞反应和诱导慢性炎症间接上调B7-H3表达。本研究结果也显示胃癌组血清B7-H3水平显著高于慢性胃炎组及健康志愿组，慢性胃炎组高于健康志愿组，提示B7-H3可能参与胃癌发生及进展。

B7-H3在胃肠道肿瘤中表达显著，而在这些器官的正常健康组织中的表达被证明是缺失或很少的。该分子能通过各种免疫和非免疫分子机制影响胃肠道肿瘤的生物学行为，其中一些是B7-H3相关信号转导途径诱导的结果，B7-H3在这些肿瘤的进展、转移中发挥着重要作用[19]。

本研究结果胃癌组织B7-H3蛋白阳性表达率显著高于癌旁组织，表明了B7-H3与胃癌进展及侵袭相关，与Li等[20]研究结果基本一致，B7-H3表达增加与胃癌浸润深度和CXCR4表达呈正相关，表明B7-H3能促进胃癌细胞迁移和侵袭，B7-H3和CXCR4可能是胃癌治疗的新靶点。可溶性B7-H3(sB7-H3)在多个肿瘤和肿瘤细胞系中的表达也出现升高，且其高表达与肿瘤的侵袭转移有显著相关性。

综上所述，检测胃癌患者血清sB7-H3水平，可以辅助判断胃癌进展侵袭转移情况，可作为胃癌诊疗潜在的分子标志物。