不同类型淋巴瘤组织中EB病毒的表达及意义

徐海芹，徐晓艳，任振娟，冯征远

(1.内蒙古医科大学基础医学院 病理教研室，内蒙古自治区 呼和浩特市010059；2.内蒙古自治区人民医院 检验科，内蒙古自治区 呼和浩特市010010；3.内蒙古自治区第四医院 检验科，内蒙古自治区 呼和浩特市010010)

恶性淋巴瘤[1](malignant lymphoma，ML)是一大类淋巴造血系统恶性肿瘤的总称。由于恶性淋巴瘤的发病机制相当复杂，因此，揭示淋巴瘤发病机制，找到行之有效的治疗方法是目前面临的问题。

近年来大量研究发现 EBV 在伯基特淋巴瘤、弥漫大 B 细胞淋巴瘤、经典型霍奇金淋巴瘤及 NK/T 细胞淋巴瘤中的检出率显著高于其他肿瘤，推测其可能在肿瘤发病过程中起到重要作用[2]。EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一种广泛存在于人类中的嗜B淋巴细胞的线性双链DNA病毒，属于人类γ疱诊病毒亚科,在全世界人群中感染非常普遍[3]。血清学研究发现，超过90%的成年人血清中EBV抗体阳性，大多数人终身 EBV 潜伏感染而无任何症状，少数情况下如机体免疫功能明显下降时，免疫系统与病毒之间的平衡被打破时可引起严重的相关性疾病。大量研究报道EBV相关的肿瘤呈人种和地域分布性，其原因可能与遗传、环境和/或病毒因素有关。由于不同来源的EBV毒株存在基因变异和生物学功能的差异，因此是否存在高致病EBV变异毒株一直是倍受关注的热点问题。LMP1被认为是EB病毒相关性肿瘤中至关重要的的因子之一,而EBERs 是所有 EBV潜伏感染类型中表达最丰富的 mRNA，是 EBV 潜伏感染的标志物。因此本组实验检测100例淋巴瘤患者中潜伏膜蛋白1(LMP1)及EBV编码的小RNA(EBER)的表达情况；观察LMP1与EBER的相关性及二者与淋巴瘤类型的相关性，为淋巴瘤的诊断提供依据。同时观察本地区EBV的表达与其他地区EBV表达的差异。

1 材料与方法

1.1 一般资料选内蒙古医科大学附属医院病理科2009年1月年到2013年1月间淋巴瘤标本共100 例，年龄在12岁至81岁之间，男62例，女38例。所有病例均经两位以上病理专家复查后确诊。

1.2 方法标本均经10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,4 μm厚连续切片，常规行HE染色。免疫组化染色采用SP法，实验步骤按照说明书进行，以PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性切片作阳性对照，鼠抗EBV LMP-1抗体(克隆号CS1-4)购自北京中杉金桥生物技术有限公司，LMP1免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；原位杂交HRP标记抗地高辛抗体法，实验步骤按照说明书进行，以PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性切片作阳性对照，EBER RNA探针(地高辛标记)购自北京中杉金桥生物技术有限公司，EBER原位杂交试剂盒(货号7001)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 结果判定LMP1阳性表达于细胞质、细胞膜及核旁体，呈棕黄色颗粒状；EBER原位杂交阳性为细胞核出现棕褐色颗粒，由两名经验丰富的病理医师分别进行独立阅片，对结果进行评定。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0软件的四格表χ2检验及精确概率法对实验结果进行统计学分析。P<0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 采用免疫组化方法检测100例不同类型淋巴瘤中LMP1的表达情况

100例淋巴瘤病例中共检测出LMP1蛋白阳性9例，阳性率为9%；其中弥漫性大B细胞淋巴瘤 56例，LMP1阳性1例，阳性率约1.79%；经典型霍奇金淋巴瘤(HL) 17例，LMP1阳性8例，阳性率47%。其余淋巴瘤的肿瘤细胞均LMP1阴性表达。见表1。

表1 不同类型淋巴瘤EBV病毒LMP1蛋白的表达情况

2.2 采用原位杂交方法检测100例不同类型淋巴瘤中EBER的表达情况

EBER是EBV编码的小RNA，在EBV感染的细胞核中高拷贝存在。结果判读：首先应观察同次所做的阳性对照和阴性对照结果。阴性对照片应为阴性结果，无任何显色；阳性对照片应为阳性结果，而且阳性部位应与靶RNA所在的核部位一致。实验结果显示，100例淋巴瘤病例中共检测出EBER阳性21例，阳性率为21%；其中NK/T细胞淋巴瘤 9例，EBER阳性8例，阳性率约89%；霍奇金淋巴瘤(HL) 17例，EBER阳性10例，阳性率约59%；弥漫大B细胞淋巴瘤 56例，EBER阳性3例，阳性率约5.36%；其余淋巴瘤的肿瘤细胞均EBER阴性表达，见表2。

表2 不同类型淋巴瘤中EBV病毒EBER的表达情况

2.3 100例不同类型淋巴瘤中LMP1及EBER的表达模式

2.3.1LMP1的表达模式

EBV LMP1阳性表达位于细胞膜、细胞质及核旁体，LMP1阳性的肿瘤细胞通常散在分布，并且除了1例血管免疫母T细胞淋巴瘤的非肿瘤细胞散在表达，其余淋巴瘤中通常无表达。LMP1阳性的淋巴瘤之间未见明确LMP1表达模式的差异及特征。

2.3.2EBER的表达模式

EBER阳性信号则定位于细胞核内，EBER阳性的肿瘤细胞通常呈簇状或片状分布、甚至弥漫分布，也会出现EBER阳性的非肿瘤细胞。100例淋巴瘤中,21例淋巴瘤的肿瘤细胞表达EBER，13例淋巴瘤中的非肿瘤细胞表达EBER；并且它们的阳性细胞数量有所不同。3例弥漫性大B细胞淋巴瘤，约大于90%的肿瘤细胞表达EBER，多为中、大细胞，呈弥漫型分布；8例NK/T细胞淋巴瘤，约30%-90%肿瘤细胞表达EBER(常常大于100个/HPF,至少大于50个/HPF)，多为中等大小细胞阳性,呈簇状或弥漫型分布；10例经典型霍奇金淋巴瘤，约100%的肿瘤细胞表达EBER，多为大细胞，散在或小簇状分布。由此推测弥漫性大B细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤及经典型霍奇金淋巴瘤的发生可能与EBV感染有关。另外13例淋巴瘤中可见非肿瘤细胞散在表达EBER。其中1例血管免疫母T细胞淋巴瘤的阳性细胞类型为小、中、大的B免疫母细胞(大于50个/HPF)，这与文献报道一致。1例滤泡细胞淋巴瘤的阳性细胞为小、中的非肿瘤细胞(10-15个/HPF)，阳性细胞较多，具体机制有待于进一步研究。其他类型淋巴瘤的阳性细胞为2-3个/HPF，细胞类型为小淋巴细胞，这可能与机体EBV潜在感染有关，在正常人鼻咽部就可以见到散在分布的EBER阳性细胞。见表3。

表3 不同类型淋巴瘤EBER的阳性表达模式

2.3.3100例不同类型淋巴瘤中LMP1与EBER表达的相关性

表1结果显示，100例淋巴瘤中EBER的表达与LMP1的表达呈正相关(χ2=5.647，P<0.05)，但EBER的阳性表达率高于LMP1的阳性表达率，可作为检测EBV病毒感染的较敏感检测方法。

表4 100例淋巴瘤中LMP1与EBER表达的相关性

3 讨论

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒。它是近年来研究较多的与肿瘤密切相关的一种致肿瘤生物因素。EBV基因组至少有85个可编码基因，这些基因可在EBV感染的潜伏阶段或裂解阶段表达。潜伏期表达的基因主要包括2种EBV编码小RNA(EBV-encoded small RNAs，EBERl和EBER2)；6种核抗原(EBV nuclear antigen，EBNA)家族，包括EBNAl、2、3A、3B、3C和主导蛋白(1eader protein，EBNA-LP)，潜伏膜蛋白(1atent membrane protein，LMP)1、2A和2B以及BamHI-A右向转录产物(BamHI-A rightward transcripts，BARTs)。在裂解性感染时，大量的病毒结构基因和调节基因表达，包括即刻早期基因、早期基因和晚期基因[4-5]。EBV潜伏感染被认为是病毒致肿瘤作用的主要机制，根据被感染细胞表面表达的抗原不同，潜伏感染分为4型：Ⅰ型潜伏感染主要见于Burkitt’s淋巴瘤(BL)，病毒表达EBNA1、EBERs和 BARTs；Ⅱ型潜伏感染主要见于鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤(HL)及NK/T细胞淋巴瘤，病毒表达EBNA1、LMPs、EBERs和 BARTs；Ⅲ型潜伏感染主要见于弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)及免疫抑制患者的淋巴组织增生性疾病，病毒表达所有的EBNAs、LMPs、EBERs和 BARTs；Ⅳ型潜伏感染仅发生在健康病毒携带者的B淋巴细胞中，病毒表达LMP2A、EBERs和 BARTs[6]。

LMP1被认为是EB病毒相关性肿瘤中至关重要的的因子之一[7-9]，由386个氨基酸(amino acid,AA)组成的跨膜蛋白构成,跨膜蛋白由3种不同结构组成：较短的N端胞浆区(AA1-24)、6个不同的跨膜疏水结构区(AA25-186)以及较长的C端胞浆区(AA187-386)，不同地域来源LMP1基因分型也不一样，将LMP1分为7个亚型[10]：B95-8、China 1、China 2、China 3、Med+、Med-、NC和Alaskan。目前LMP1被公认为是鼻咽癌重要的外源癌基因及促转移基因，可以通过P13K/AKt、NF-Kb、MAPKs、JKA/STAT等多条信号通路对MMPs、VEGF、EGFR、COX-2、E-cadherin等多个转移基因起调控作用，影响鼻咽癌的转移[11-15]。而LMP2也可以通过多个信号通路如P13K/AKt、泛素介导的Wnt和Notch信号通路和STAT等对肿瘤的发生发展起促进作用[16-17]。另有研究显示LMP1的表达水平与NK/T细胞淋巴瘤的放疗敏感性相关，低表达者较高表达者放疗敏感性高，放疗疗效好。提示LMP1可能作为疗效判定的分子标志物和潜在治疗靶点[18]。

EBERs 是所有 EBV潜伏感染类型中表达最丰富的 mRNA，每个细胞中高达 106-107拷贝，是 EBV 潜伏感染的标志物[19-20]，EBERs的致癌作用已在淋巴瘤、NPC 和胃癌等多种细胞系中得到证实[21-27]，EBERs 原位杂交定位检测是诊断活检组织中 EBV 潜伏感染的金标准[19-20]。EBERs 原位杂交显示 EBERs 主要分布于细胞核中[28-29]，利用高分辨原位杂交技术，通过激光共聚焦显微镜可观察到 EBERs 在间期细胞的细胞质和细胞核中均有分布，表明 EBERs 与分布于核周边区域的粗面内质网(rER)和高尔基复合体关系密切[30]。鉴于 EBERs 即可与细胞核内的蛋白结合，也可以与细胞质中的蛋白质结合，推测 EBERs也可分布于细胞质中[31-34]。

大量研究显示EBV与多种疾病的发生密切相关，例如传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis，IM)、EBV相关淋巴组织增殖性疾病(Epstein-Barr virus-relatedlymphoproliferative disorders，EBV-LPD)、NK 细胞白血病/淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、Burkitt 淋巴瘤和鼻咽癌等[31]。在EBV表达的潜伏蛋白中，LMP1的作用尤为重要。并且EBV小RNA EBERs的表达贯穿整个潜伏感染过程中。因此本实验检测100例该地区淋巴瘤中LMP1及EBERs的表达及其意义。

本次研究100例淋巴瘤病例，其中共检测出LMP1蛋白阳性9例，LMP1总阳性率9%；其中弥漫性大B细胞淋巴瘤 56例，LMP1阳性1例，阳性率约1.79%；经典型霍奇金淋巴瘤(HL) 17例，LMP1阳性8例，阳性率47%；其余淋巴瘤均为阴性。经典型霍奇金淋巴瘤(HL)LMP1阳性表达率高于总体淋巴瘤LMP1阳性表达率(P<0.05),具有有统计学意义，表明EBV在霍奇金淋巴瘤中的感染率较高，这与以往的研究结果一致[35]。在弥漫大B细胞淋巴瘤中，LMP1有一定的的阳性表达，说明某些弥漫大B细胞淋巴瘤的发生可能与EBV感染相关，有待于对弥漫大B细胞淋巴瘤的类型及发生机理进一步探讨和研究。在本次研究中，9例NK/T细胞淋巴瘤均不表达LMP1，推测NK/T细胞淋巴瘤可能与EBV引起的Ⅰ型潜伏感染有关，也可能是由于地区差异导致或者由于病例较少造成，还有可能是免疫组化检测LMP1的敏感性较低，这有待于进一步研究。从EBV LMP1的表达模式看，其阳性表达位于细胞膜、细胞质及核旁体，LMP1阳性的肿瘤细胞通常散在分布，并且除了1例血管免疫母T细胞淋巴瘤中非肿瘤细胞有散在表达外，其余淋巴瘤均看不到非肿瘤细胞表达。LMP1阳性的淋巴瘤之间未见明确LMP1表达模式的差异及特征。

通过原位杂交来检测100例淋巴瘤病例中EBER的表达情况(注：本实验使用的EBER探针为EBER1与EBER2的混合探针)，结果显示：100例淋巴瘤病例中共检测出EBER阳性21例；其中弥漫性大B细胞淋巴瘤 56例，EBER阳性3例，阳性率约5.36%；NK/T细胞淋巴瘤 9例，EBER阳性8例，阳性率89%；霍奇金淋巴瘤(HL)17例，EBER阳性10例，阳性率59%；其他类型淋巴瘤均为阴性。由此说明，弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤及NK/T细胞淋巴瘤与EBV感染的关系最密切。其中NK/T细胞淋巴瘤EBER阳性率明显高于弥漫大B细胞淋巴瘤EBER阳性率(P<0.05)，具有统计学意义，与以往研究结果一致[36]；霍奇金淋巴瘤EBER阳性率明显高于弥漫大B细胞淋巴瘤EBER阳性率(P<0.05)，具有统计学意义，表明EBV感染可能对霍奇金淋巴瘤致病性高于弥漫大B细胞淋巴瘤。本组病例中间变大细胞淋巴瘤2例，伯基特细胞淋巴瘤1例，均未检测到EBER的表达。这可能与标本固定不当、石蜡组织中RNA的降解及实验前处理等实验因素有关，属于偶然事件；但也不能除外地区差异所致，有待于收集大样本病例进一步研究。从EBER的表达模式看，EBER阳性信号则定位于细胞核内，EBER阳性的肿瘤细胞通常呈簇状或片状分布、甚至弥漫分布，也会出现EBER阳性的非肿瘤细胞。100例淋巴瘤中,21例淋巴瘤的肿瘤细胞表达EBER，13例淋巴瘤中的非肿瘤细胞表达EBER；并且它们的阳性细胞数量有所不同。3例弥漫性大B细胞淋巴瘤，约大于90%的肿瘤细胞表达EBER，多为大细胞，呈弥漫型分布；10例NK/T细胞淋巴瘤，约30%～90%肿瘤细胞表达EBER(常常大于100个/HPF,至少大于50个/HPF)，呈簇状或弥漫型分布；8例经典型霍奇金淋巴瘤，约100%的肿瘤细胞表达EBER，多为大细胞，散在或小簇状分布。由此推测弥漫性大B细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤及经典型霍奇金淋巴瘤的发生可能与EBV感染有关。另外13例淋巴瘤中可见非肿瘤细胞散在表达EBER。其中1例血管免疫母T细胞淋巴瘤的阳性细胞类型为中、大的B免疫母细胞(大于50个/HPF)，这与文献研究一致。1例滤泡细胞淋巴瘤的阳性细胞为小、中的非肿瘤细胞(10～15个/HPF)，阳性细胞较多，具体机制有待于进一步研究。其他类型淋巴瘤的阳性细胞为2-3个/HPF，细胞类型为小淋巴细胞，推测可能伴有EBV的潜伏感染，肿瘤的发生可能与EBV感染无关。

另外，原位杂交的方法检测(EBER)EBV在不同淋巴瘤患者中的阳性表达率高于免疫组化方法检测(LMP1)EBV在不同淋巴瘤患者中的阳性表达率(P<0.05),具有统计学意义。一方面表明原位杂交的方法检测(EBER)EBV感染情况较免疫组化方法检测(LMP1)EBV更敏感，这与以往的研究结果相一致。另一方面可能一些淋巴瘤，尤其本实验中一组NK/T细胞淋巴瘤均LMP1阴性，但EBER均阳性，说明该组淋巴瘤的发病机制可能与EBV引起的Ⅰ型潜伏感染有关，不会产生LMP1潜伏蛋白，可能与该地区区域性相关。这与以往研究认为NK/T细胞淋巴瘤与Ⅱ型潜伏感染相关不一致，有待于收集大样本病例进一步研究和探索。另外，从LMP1及EBER的表达模式看，EBER在某些淋巴瘤中通常弥漫表达，而LMP1阳性的肿瘤细胞通常散在分布。所以，从EBER和LMP1的阳性分布情况也可以看出EBER原位杂交的检测方法较为敏感，对淋巴瘤的辅助诊断方面优于LMP1免疫组化的方法，与以往的研究结果一致[37]。并从实验发现，EBER和LMP1的表达具有明显相关性，二者通常情况下伴随表达。

综上所述，EBV基因组结构复杂，表达的蛋白及基因产物较多。其与多数肿瘤发生、发展密切相关，目前针对淋巴瘤的研究较多。本实验研究发现，NK/T细胞淋巴瘤及经典型霍奇金淋巴瘤与EBV感染密切相关，一部分弥漫性大B细胞淋巴瘤伴有EBV的感染，可辅助淋巴瘤的病理诊断及判定淋巴瘤的类型。EBV潜伏膜蛋白LMP1与EBER表达具有相关性，原位杂交检测EBER的方法较免疫组化检测LMP1的方法较为敏感。