猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP4研究进展

沙惠阳，张 航，黄良宗，马春全，赵孟孟

(佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山 528231)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染引起的一种高度接触性传染病。PRRS俗称猪蓝耳病，由于PRRSV入侵会降低生猪免疫力，常伴随混合感染而使疾病很难得到有效防控。1987年该病首次在美国报道，1990年荷兰成功分离PRRSV并命名Lelystad virus(LV)株，1991年在美洲分离出VR2332株，2种PRRSV基因组序列差异较大并分别命名为欧洲株基因Ⅰ型和美洲株基因Ⅱ型。1996年中国首次成功分离到PRRSV[1]，命名为CH-1a。刘光清[2]等对PRRSV CH-1a株ORF1进行测序分析，结果表明ORF1全长11882 bp，与LV株同源性较低，与VR2332株同源性较高。2006年中国暴发以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)为主要病原的“高热症”[3]，HP-PRRSV成为中国具有更高致病力流行株，2015年以后NADC-30 like毒株为流行毒株[4]，给中国养猪业造成更严重损失。目前一直没有针对该病毒的有效药物，疫苗的效果也有限，不断重组与变异的PRRSV使得PRRS防控形势更加严峻。

PRRSV是一种不分节段、有囊膜单股正链RNA病毒，核衣壳外围包被脂质双层膜，对一些脂类溶剂如乙醚、氯仿敏感，这些物质会溶解脂质双层膜而使病毒失活。PRRSV 基因组包括10个开放阅读框(open reading fame，ORF)。ORF1a和ORF1b占据整个PRRSV基因组3/4，翻译形成2个多聚蛋白pp1a和pp1ab。pp1a和pp1ab可被NSP4水解成13个非结构蛋白，即NSP lα、NSP lβ及NSP2～NSP12，PRRSV基因组编码8个结构蛋白GP2a、E、GP3、GP4、GP5、GP5a、M、N。

NSP4具有3C样丝氨酸蛋白酶(3CLSP)活性，最适温度为8℃，最适pH为7.5，该酶能够适应高浓度Na+环境，对二价金属离子(Zn2+、Cu2+)具有较高敏感性且蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸(EDTA)和苯甲基磺酰氟(PMSF)能抑制NSP4 3CLSP活性。NSP4可通过铰链区(hinge region)信号作用主动进入细胞核，因此细胞核存在大量NSP4而细胞浆少量存在，铰链区145-168位氨基酸可影响NSP4核定位。很多病毒与宿主相互作用过程中通过抑制IFN逃避宿主免疫反应，其中PRRSV NSP4能抑制IFN-I产生，且该抑制作用与3CLSP 活性密切相关。PRRSV 3CLSP晶体结构由3部分组成，2个反向平行β折叠桶(结构域Ⅰ和结构域Ⅱ)和1个C末端α/β结构域(结构域Ⅲ)。NSP4 3CLSP活性区域位于结构域Ⅰ和结构域Ⅱ之间，第39位组氨酸(His)、第64位天冬氨酸(Asp)和第118位丝氨酸(Ser)构成His-Asp-Ser 催化三联体，是NSP4发挥3CLSP活性重要氨基酸位点，这3个氨基酸突变会使3CLSP丧失蛋白酶活性[5]。NSP4 3CLSP参与诱导细胞凋亡反应，可以作为一种重要靶蛋白揭示PRRSV复制机理。NSP4在PRRSV复制早期出现，PRRSV感染早期可在宿主体内检测到NSP4抗体[6]。对NSP4功能进一步解析，将有助于探索PRRSV免疫逃逸与持续感染，为防控PRRS提供理论基础。作者对NSP4遗传变异、对病毒复制影响、诱导细胞凋亡、调节宿主免疫、调控抗病毒反应、与宿主相互作用、在PRRSV检测方面进行综述，为疫苗设计与开发药物提供理论参考。

1 NSP4遗传变异分析

NSP4基因高度保守，董建国[7]通过对HP-PRRSV HuN4株与PRRSV CH-1a株NSP4氨基酸序列进行比对，发现高致病性HuN4株和CH-1a株NSP4 氨基酸(aa)相似性高达96.5%，仅在7个aa位点存在差异，CH-1a株的第6、76、80、154、178、185、186位的氨基酸分别为精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、缬氨酸(Val)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)，而HuN4株则分别为苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、赖氨酸(Lys)、异亮氨酸(Ile)、天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)。此外，NSP4催化三联体His39-Asp64-Ser118序列保守性高，未发生突变。其中PRRSV NSP4第185位天冬氨酸(Asp)发生突变，影响NSP4切割核转录因子(NF-κB)必要调节蛋白(NEMO)和MAVS的能力，从而调控IFN-Ⅰ表达[8]。其他氨基酸突变是否对空间构象造成影响，该影响是否与病毒毒力、细胞噬性相关，还需进一步试验验证。Wang[9]等发现NADC30-like株与国内流行疫苗株在NSP4发生重组，是否影响疫苗效果还需进一步研究。

2 NSP4对病毒复制影响

在非结构蛋白前体多聚蛋白pp1a和pp1ab加工过程中，NSP4作为一种重要的复制和转录酶，切割PRRSV增殖过程中的多聚蛋白，并且NSP4负责NSP3～NSP12切割。Tian[10]等通过人工合成10条多肽并以之为底物(含NSP4预测切割位点)，通过“多肽底物-反相高效液相色谱”方法体外测定蛋白酶活性，发现NSP4可顺式切割NSP4-NSP5，Tian[6]等证实NSP4可反式切割NSP3-NSP4和NSP11-NSP12，NSP4不能在体外切割NSP8-NSP9[11]。董建国[7]利用大肠埃希氏菌表达系统表达并纯化PRRSV HuN4株和CH-1a株NSP4重组蛋白，建立体外测定NSP4酶动力学方法，以及PRRSV NSP4荧光定量PCR方法，结果表明CH-1a NSP4体外切割NSP11-NSP12效率高于HuN4株，但HuN4株NSP4基因转录水平高于CH-1a株，导致整体上HuN4 NSP4酶催化效率高于CH-1a株，进而快速切割NSP11-NSP12。NSP11可抑制IFN-β产生和宿主先天性免疫，有利于PRRSV增殖，使得相同时间内 HuN4株病毒粒子生成数量多于CH-1a株。Liu[12]等从含骆驼重链抗体可变区噬菌体展示文库中分离出3个PRRSV NSP4特异性纳米抗体(Nb41、Nb42、Nb43)，利用慢病毒载体将纳米抗体基因导入Marc-145细胞，测试这些细胞内表达的纳米抗体与PRRSV NSP4是否互作。结果表明，Nb42识别NSP4非功能表位，Nb41和Nb43通过识别NSP4功能表位抑制PRRSV复制 ，并在0.001感染复数(MOI)或更低感染复数下完全阻断PRRSV复制。

3 NSP4诱导细胞凋亡

在PRRSV所有结构和非结构蛋白中，NSP4作为最主要凋亡诱导蛋白，一方面可激活促凋亡蛋白Bim，另一方面能够降解抗凋亡蛋白Bcl-xL，诱导细胞凋亡，凋亡与其3CLSP密切相关[13]。在凋亡过程中，NSP4发挥生物学功能需要宿主细胞蛋白参与，NSP4可以与细胞色素C1(cyto.c1)蛋白互作。NSP4和cyto.c1能在细胞质中共定位，NSP4剪切cyto.c1蛋白具有剂量依赖性特点，而且NSP4任一酶活性氨基酸位点突变均丧失剪切cyto.c1蛋白能力，cyto.c1蛋白E230aa-G231aa是决定NSP4能否切割cyto.c1蛋白关键位点[14]。

4 NSP4调节宿主免疫

NSP4在调节宿主免疫方面发挥极其重要的作用。NF-κB必要调节蛋白NEMO是诱导IFN产生的关键蛋白，仙台病毒(SEV)作用于NEMO缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)时，MEF由于缺失NEMO使干扰素调节因子3(IRF3)磷酸化过程受阻，导致IFN-β产生受到抑制。PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)可抑制IFN-β表达，该抑制作用通过NSP4切割NEMO途径实现。NSP4在细胞质多个位点与NEMO特异性的相互作用。Chen J Y等研究表明将PRRSV NSP4 第64位的D突变为A后，发现野生型NSP4(NSP-WT)能够切割宿主蛋白NEMO，而酶活性缺失体不能切割NEMO，得出该切割作用与NSP4酶活性有关，酶活性缺失体不能抑制IFN-β表达[15]。

线粒体定位抗病毒蛋白(MAVS也称IPS-1、VISA或CARDIF)，缺失会减弱机体对IFN-β的诱导作用。不同PRRSV对IFN-β抑制作用不同，黄琛[16]在PAM验证出HP-PRRSV NSP4比传统株CH-1a NSP4对IFN-β抑制作用更强，HP-PRRSV感染明显下调VISA蛋白水平，但 CH-1a对VISA表达没有作用。HP-PRRSV NSP4能够切割维甲酸诱导基因-I(RIG-I)/黑色素瘤相关基因5(MDA5)信号通路中重要接头分子MAVS及NEMO，NSP4能够同时抑制IRF3磷酸化和NF-κB活化。HP-PRRSV NSP4切割MAVS及抑制IFN-β的产生依赖其3CLSP活性，与蛋白酶体和细胞凋亡途径无关。HP-PRRSV NSP4切割接头分子MAVS的位点位于MAVS第268位谷氨酸(Gln)，切割之后形成两个片段，使得MAVS丧失诱导IFN-β能力。

NSP4抑制IκB激酶复合体α(IκB kinase α，IκKα)对IFN-β的诱导表达。PRRSV NSP4作为一个丝氨酸蛋白酶与IκKα相互作用，在IκKα两端特异切割IκKα，NSP4蛋白酶活性在抑制IκKα激活NF-κB通路和IFN-β启动子活性中发挥关键作用，其NSP4保守氨基酸序列His39-Asp64-Ser118催化三联体任一位点发生氨基酸突变都会影响对IκKα切割，该结果有助于揭示PRRSV逃逸宿主天然免疫机制[17]。

NSP4切割信号转导及转录激活酶2(STAT2)抑制IFN-β表达。PRRSV NSP4蛋白在拮抗JAK-STAT信号通路中发挥重要作用，PRRSV NSP4蛋白依赖其自身丝氨酸蛋白酶活性切割JAK-STAT信号通路中重要信号分子STAT2。在JAK-STAT信号通路传递途径中，STAT2与STAT1结合形成异源二聚体，NSP4切割STAT2致使异源二聚体缺乏，干扰素刺激基因因子3(ISGF3)复合体不能与干扰素刺激元件ISRE结合，拮抗IFN-β生成，同时鉴定出NSP4切割STAT2位点是E719[18]。

NSP4可通过多种途径切割多个信号分子来实现对IFN-β的调控，相关研究表明NSP4氨基酸突变对NSP4诱导IFN-β产生影响。NSP4在细胞核抑制IFN-β产生，NSP4第155位苏氨酸(Thr)被赖氨酸(Lys)取代可以增加NSP4在细胞核中的分布，从而抑制IFN-β体外转录[19]。HP-PRRSV NSP4第185位天冬氨酸(Asp)发生突变，会使NSP4切割NF-κB必要调节蛋白(NEMO)和MAVS能力受损，从而拮抗IFN-β产生[8]。

丁国飞[20]等通过NSP4蛋白质组学方法筛选到包括转绿因子Snf2相关CBP激活蛋白(SRCAP)在内的42个可能与NSP4互作细胞蛋白，进一步发现PRRSV感染细胞后，NSP4与SRCAP互作激活Notch信号通路，从而促进PRRSV的增殖与复制，揭示了一种全新PRRSV感染机制。

巨噬细胞清道夫受体A(SRA又称CD204)，可以帮助吞噬细胞识别致病菌。有报道PRRSV侵入机体后，NSP4可通过直接与SRA启动子-84到-214区域结合抑制SRA基因转录，帮助PRRSV逃逸宿主免疫反应。通过与紫外线(UV)灭活的 PRRSV 比较，未灭活的PRRSV感染抑制 SRA转录，紫外线UV灭活的PRRSV不能抑制SRA转录，NSP4调控 SRA转录与PRRSV复制有关[21]。

猪感染HP-PRRSV会阻滞猪白细胞抗原Ⅰ类(SLA-Ⅰ)抗原呈递途径。HP-PRRSV感染抑制β2微球蛋白(β2M)的表达，β2M与SLA-I重链和可变肽形成异源三聚体复合物，在SLA-Ⅰ抗原呈递过程中发挥着关键作用[22]。NSP4外源性表达在mRNA和蛋白质水平下调β2M的表达，并降低细胞表面SLA-Ⅰ表达。

5 NSP4调控抗病毒反应

PRRSV感染Marc-145细胞显著下调外源性锌指抗病毒蛋白(ZAP)表达，NSP4利用3CLSP切割ZAP，从而拮抗ZAP抗病毒作用，NSP4第180位丝氨酸(Ser)是降解ZAP所必需，180位氨基酸突变下调PRRSV降解ZAP能力，从而拮抗其抗病毒作用[23]。杨玉婷[24]通过Western blot发现NSP4在E411位点切割ZAP的能力与NSP4含量呈正相关，自噬溶酶体途径和泛素-蛋白酶体途径不影响NSP4切割ZAP，NSP4酶活突变体丧失对ZAP切割能力，NSP4切割ZAP依赖3CLSP。mRNA脱帽酶1a(DCP1a)是一种免疫调节因子，参与从真核mRNA中去除5′-甲基鸟苷帽，被鉴定为干扰素刺激基因，NSP4也可切割猪mRNA脱帽酶1a(pDCP1a)。PRRSV感染不影响pDCP1a mRNA转录和亚细胞定位，通过切割pDCP1a显著下调pDCP1a的表达，从而致弱pDCP1a抗病毒活性，切割位点位于pDCP1a第238位谷氨酸(E238)[25]。

6 NSP4与宿主相互作用

猪核糖核酸酶L(sRNase L)是一种干扰素诱导产生的抗病毒蛋白，sRNase L激活后参与一系列机体免疫反应，抑制PRRSV在宿主细胞增殖。张梅洁[26]通过构建荧光素酶活性试验发现与sRNase L互作的PRRSV蛋白是NSP4、NSP12和N，且在细胞内共定位。尹曼曼[27]筛选PAM cDNA文库中与NSP4相互作用的宿主蛋白，发现猪免疫球蛋白lambda轻链相似肽5(sIGLL5)与NSP4互作，NSP4和sIGLL5在HEK-293细胞共定位。PRRSV感染过程中，NSP4可通过与TRIM蛋白家族成员TRIM28互作，介导部分TRIM28以核转录蛋白CRM1依赖方式从细胞核转移至细胞浆中。出核TRIM28作为E3泛素连接酶，使早期自噬调控分子Vps34发生类泛素蛋白修饰，增强Vps34和自噬关键调控蛋白复合物Beclin1互作，进而调控细胞自噬体形成[28]。该研究揭示了PRRSV诱导细胞自噬的新分子机制，从蛋白翻译后修饰角度阐明了PRRSV与宿主细胞的互作机制。RBM39(RNA binding motif protein 39)通过与NSP4互作调节c-Jun磷酸化，进而促进PRRSV感染[29]。此外NSP4可与F-action和myosin ⅡA互作，完成PRRSV在细胞之间的传递与感染[30]。

7 NSP4在PRRSV检测方面应用

NSP4在病毒复制早期出现，并切割其他非结构蛋白，在PRRSV复制周期中存在较长时间，机体感染早期可检测到NSP4抗体，可用于检测PRRSV早期感染。同时，NSP4主要是在病毒复制过程中产生，用NSP4作为诊断抗原检测NSP4抗体可区分自然感染与灭活疫苗免疫接种。Brown E[31]等克隆表达VR2332株NSP1、NSP2、NSP4、NSP7和NSP8，并且以这些蛋白作为包被蛋白分别建立ELISA方法，结果表明NSP2 ELISA和NSP7 ELISA检测效果最好，NSP4 ELISA与待检血清反应弱于前两者。刘磊[32]等以NSP4重组蛋白作为包被抗原，建立了NSP4抗体ELISA检测方法，并与爱德士IDEXX ELISA检测结果对比，总符合率为93.19%，结果说明PRRSV NSP4是具有良好潜力的候选蛋白。Cao[33]等开发NSP4蛋白包被间接ELISA(NSP4涂层iELISA)，并将其效果与N涂层iELISA进行了比较，结果表明NSP4涂层和N涂层iELISAs之间一致性为92.2%。此外，检测了50份接种HP-PRRSV猪血清样本，用NSP4包被iELISA检测出PRRS抗体阳性，但N包被iELISA检测结果阴性，Western blot分析结果与NSP4包被和NSP2包被iELISA分析结果一致性分别为92%和96.1%。结果表明大部分采集自接种活HP-PRRSV菌株的猪血清样本，其N包被iELISA检测结果阴性，NSP4包被iELISA检测结果阳性，因此使用NSP4包被iELISA可以帮助区分HP-PRRSV疫苗的假阴性和真阴性反应。

8 小结

PRRSVNSP4参与多种免疫抑制反应，NSP4具有3CLSP活性，在PRRSV复制、抑制宿主IFN-β产生、诱导宿主细胞凋亡以及在PRRSV检测等方面具有重要作用[9,34]。PRRSV NSP4基因保守性较高，不同PRRSV之间氨基酸相似性高，根据这一特性未来可开发出针对PRRSV 的高效新型检测试剂与检测方法。

PRRSV作为一种免疫抑制性病毒，进化出多种策略逃逸宿主抗病毒天然免疫反应。PRRSV除了能抑制IFN-β产生，还可靶向干扰素诱导基因(ISGs)拮抗宿主抗病毒反应。研究病毒如何逃逸宿主免疫有助于深入解析宿主免疫反应调控机制。作为PRRSV编码的一种重要蛋白酶，NSP4在拮抗宿主天然免疫反应中发挥重要作用，NSP4除拮抗IFN-Ⅰ信号通路，还可激活Notch信号通路、调控抗原呈递途径、参与诱导细胞凋亡等方面协助病毒逃逸宿主免疫应答。NSP4与多种宿主蛋白互作，NSP4具有切割宿主蛋白的作用，这可能成为PRRSV 逃逸宿主免疫反应的主要机制之一。深入研究PRRSV NSP4调节宿主免疫反应机制有助于深入了解PRRSV致病机理并确定其毒力因子，以此为前提可为弱化PRRSV、开发有效疫苗提供新靶点和理论基础。

PRRSV NSP4作为主要蛋白酶之一，在病毒增殖中发挥重要作用，3C样丝氨酸蛋白酶特征成为药物设计重要靶点[17,19]。纳米抗体作为治疗PRRSV感染的新型抗病毒药物，有巨大发展潜力。Shi[35]团队开展靶向NSP4抗病毒药物筛选，得到2种抑制效果显著的抗病毒候选药物。迄今为止，PRRSV仍在全球流行，对养殖业危害巨大，有效防控PRRSV仍是世界性难题，研究PRRSV分子致病机制可为预防与控制该病提供科学依据。