食源性单核细胞增生李斯特氏菌检测方法研究进展

刘洪蕾，王 真

(北京农学院动物科学技术学院，北京 102206)

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,LM)简称单增李斯特氏菌，是李斯特氏菌属中唯一的一种人畜共患病的病原菌，为革兰氏阳性兼性厌氧胞内寄生菌，常见于食品中，人、畜及禽类均可被感染而引起李斯特氏菌病。在生物膜的作用下单增李斯特氏菌可在极端的情况下生长存活，同时具有耐高盐、抗酸碱的特点。因其对环境及理化因素的抵抗力极强，故而可在自然界中广泛存在，又因为该病原菌可在4℃条件下生长繁殖，也是在冷藏食品中对人类健康产生威胁的主要致病菌之一[1-2]。食品作为传播中的一个重要传染源，因此在食品的预处理加工、运输、保藏过程中都有可能造成不同程度的LM污染，人食用污染的食品后可能会引起相应的李斯特氏菌病，出现一系列临床反应如肠胃炎、脑膜炎、败血症、胎儿流产、单细胞增多等，在各个年龄层均可能引起发病，其中新生儿、老年人、孕妇以及免疫低下者的发病率最高。在主要的食源性致病菌中，单增李斯特氏菌感染引起的病死率最高达20%～40%[3-5]。世界卫生组织(WHO)将单核细胞增生李斯特氏菌列为四大食源性的致病菌之一。

经济的迅速发展和人民生活水平在近些年来不断提高，以至于人民的生活质量也得到了极大的改善并有了更高的追求，食品安全也成为了民生关注的问题，有关于食品污染及食源性致病菌疾病的公共卫生问题也逐渐成为热门话题之一。沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特氏菌是目前国内的禽肉食品中较为常见的3种食源性致病菌。经统计，食源性疾病的发病率逐步升高，在各种疾病的总发病率中排名靠前。因此，对食品中单增李斯特氏菌的及时监测尤为重要，目前检测方法主要有传统鉴定法、分子学检测法、免疫学检测法等[6]。本文将对上述检测方法的研究进展对比分析，为选择和建立更加敏感、高效的单增李斯特氏菌检测方案提供依据参考。

1 传统分离鉴定法

平板培养法是用于单增李斯特氏菌检测的传统方法，用选择性培养基进行富集可抑制背景菌群生长，并对目标病原体进行选择性增殖以便于其分离检测。通过对分离菌落进行染色镜下观察、生化鉴定、动力试验、血清学试验等可得出定性检测结果[7]。平板培养法灵敏度高，成本低，可给出定性和定量结果，但操作步骤多，过程较复杂，从培养得到可疑菌落到检测得出确定结果，整个周期需要5 d～14 d[8]，对有效预防和控制食源性致病菌疾病的暴发有些困难。

2 分子生物学检测技术

2.1 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测技术是分子生物学技术中较为传统的技术，该方法主要通过细菌的特异毒力基因序列来设计特异性强的引物，对目的基因进行扩增后完成单增李斯特氏菌的检测工作，hlyA、plcB、actA、inlA、prfA等靶基因是PCR中比较常用的[9-10]。

2.2 多重PCR

多重PCR的原理是根据不同基因序列设计2对及以上引物，在同一反应体系中进行双基因的扩增，可以检测同一致病菌或不同致病菌，特异性更强，减少了酶、试管等相关实验用品的成本，并且可实现样本高通量检测[11-13]。但是该方法对引物特异性要求很高，易引发相互干扰导致扩增效率下降。韩笑[14]利用李斯特氏菌属和单增李斯特氏菌的特异性引物，用免疫磁珠捕获得到的菌体作为模板建立免疫磁珠-双重PCR联用的LM检测方法，优化后的条件下该方法对纯培养菌灵敏度达106CFU/mL。胡冰雪[12]等分别设计了针对LM、荧光假单胞菌和沙门氏菌的致病基因(hlyA、gyrB、invA)的特异性引物，用多重PCR技术同时检测3种标准菌株，结果显示纯菌DNA检测限可达1 pg/μL，表明该方法具有较高的特异性。Parichehr[15]等通过制备一种新的单一非选择性预富集培养基(ELSS)，进行mRT-PCR检测和定量。结果在ELSS中预富集16 h后，用mRT-PCR检测污染牛奶中每种病原菌的检出限为1 CFU/25 mL，包容性和排他性均达到100%。

2.3 实时荧光定量PCR

实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)技术是在传统PCR的基础上在反应体系中加入荧光染料或者荧光探针，随着目的片段的扩增，荧光信号不断积累变化，通过检测器上荧光信号的变化实时监测扩增过程，再根据标准曲线对目标菌进行定量，这种检测技术具有高特异性，实现了PCR技术从定性到定量的飞跃[16]。同时，反应是在密闭体系中进行的，无需进行琼脂糖凝胶电泳实验可避免交叉污染。荧光定量PCR作为近年流行起来的一项新技术，既具有探针高度特异性、核酸扩增高效性和容易定量分析等的优势，也摒弃了普通PCR易污染、无法定量分析等缺点。不过，该方法的测试成本较高，而且酶的生物活性也很易被各种食品基质成分所影响和控制，对引物和探针上的特异性靶基因序列选取和设计要求也相当高，如果选取和设计错误很可能会大大降低检验敏感度和特异性[17，18]。田小兰[19]建立了利用qPCR技术对单增李斯特氏菌的特异性检测体系，检测结果显示qPCR对LM的纯培养菌液检测限为1.12 CFU/mL，在人工污染的鱼肉样品中qPCR对单增李斯特氏菌检测限达1.12×101CFU/mL。

2.4 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是在恒温条件下利用有链置换活性特点的聚合酶，通过设计特异性引物进行核酸扩增，可以直接通过肉眼判断检测结果，观察离心管的底部是否有白色的沉淀生成[20]。与常规 PCR相比，LAMP不需要温度变化、电泳、紫外线观察结果，扩增效率极高，整个扩增只需在一个水浴锅中恒定温度30 min～60 min即可完成，其优点是快速、简单、特异性强、灵敏度高[21]。此项技术不用专门的PCR相关仪器就能满足现场、高通量快速检测的需求，而且成本比荧光定量PCR大大降低。但它也存在缺点，就是引物设计严格、要求扩增序列的长度小于300 bp、检测时极易被污染，因而产生假阳性[22]。田小兰[19]建立LM的特异性LAMP检测体系，表明在60 ℃时纯培养菌液LAMP扩增效果最好，单增李斯特氏菌的检出时间为32 min，检出限最低为2.0×101CFU/mL。周振森[23]等针对LM的特异性溶血素基因(hly)设计了多组引物，通过对引物对进行筛选配比进行优化确立了检测LM的实时荧光RT-LAMP方法，结论为对单增李斯特氏菌的菌悬液灵敏度为101CFU/mL，是RT-qPCR方法检测灵敏度的10倍。直接检测人工污染模型样品的检出限为103CFU/mL，但是对样品进行16 h增菌后，检出限即可提高到100 CFU/ 25 mL。Ledlod[24]等结合环介导等温扩增和双向侧流层析技术试验用于单增李斯特氏菌的鉴定。结果显示基因组DNA和纯培养物的方法检测限分别为900 fg和20 CFU/mL，且与其他18种致病菌没有交叉反应。在100份食品样品中与其他标准检测方法相比达到100%的准确性。

2.5 基因芯片技术

基因芯片技术的原理是使用已知的核苷酸序列作为探针与待检测样品的标记基因结合，两者进行杂交，芯片通过荧光检测器进行扫描分析信号从而得到检测结果。一个基因芯片上，可以加多个探针，实现一个实验同时检测出多种致病菌。因此，基因芯片技术通过提高检验效率，以实现食源性致病菌的高通量检测分析，缩短时间，节省资源。杨彤等[25]利用特异性探针Lm-16S-2初步建立单增李斯特氏菌液相肽核酸荧光原位杂交方法，试验结果显示特异性很强，与传统细菌生化鉴定法敏感性相同，检测限均为104CFU/mL，且重复性、稳定性好。

3 免疫学检测技术

免疫学检测技术原理是利用抗原抗体的特异性结合，对待检样品进行定性或定量分析，该技术的优点主要有操作简便、灵敏、快速、可同时检测大量样品等。目前的免疫学检测方面常用的技术主要有免疫磁分离技术、酶联免疫吸附试验和免疫层析法等。

3.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immune-sorbent assay，ELISA)是基于抗原或抗体能吸附在固相载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检样品后抗原或抗体与酶结合形成的复合物，再与底物反应，经催化后变为有色产物，根据颜色反应的深浅对待检样品进行定性或定量的分析，通常使用的有间接ELISA、夹心ELISA。它相较于其他技术比操作较容易，特异性强，灵敏度高，标准化程度较高，并且可以对大批量样品进行同时检测，但单克隆抗体应用时制备昂贵、洗板等操作过程繁琐、成品试剂盒成本高。赵萌[26]利用兔源多抗(IgG)和鸡源多抗(IgY)经过纯化后建立了LM双抗夹心ELISA检测方法，优化条件后对该方法进行评价，其检测限为6×106CFU/mL，定量限为1.2×107CFU/mL。

3.2 免疫层析法

免疫层析技术通常在毛细管的作用下，以胶体金、荧光素、量子点等多种作为标记材料，在硝酸纤维素膜等固相载体上抗原与抗体发生特异性结合反应，可利用标记材料的显色作用或荧光效应肉眼直接观察检测条带，或者通过测量荧光强度得到结果来进行定性定量分析[27]。该方法对操作人员条件要求低，也无需昂贵的仪器设备，检测时间短(10 min～15 min)，且容易进行现场的快速测定，故主要用作定性或半定量筛选手段。但是该方法敏感性低，检测结果容易受周围检测环境的影响。张赛[28]利用免疫荧光层析筛选出了合适的配对抗体，并优化试纸条性能，结论得出试纸条抗体标记浓度为0.6 mg/mL，检测线的抗体浓度为2 mg/mL，层析时间是20 min的最佳条件；纯培养物的检测限为4×105CFU/mL，人工污染样品最低检测到4×105CFU/mL。张帅等[29]制作的胶体金免疫层析试纸可以同时进行生鲜肉中的单增李斯特氏菌、志贺氏菌和沙门氏菌检测，3种致病菌灵敏度均可达1×104CFU/g。

3.3 免疫磁分离技术

免疫磁分离技术(immunomagnetic beads，IMBS)是对具有超顺磁性特性的微颗粒表面进行修饰，使之能与相应的抗体发生特异性结合，结合后可形成特异性抗体-免疫磁珠复合物，在磁场条件下两者进行分离，以达到富集靶标抗原的目的。此方法技术特异性高，敏感性好，分离富集快速，应用范围广泛。在实际应用中，该方法可以单独使用或与ELISA技术、PCR技术等联合使用以缩短检测时间，改进和增强方法的灵敏度。但是该技术的不足是其对靶标抗原的特异性要求很高，否则容易捕获到许多杂菌。李敏等[30]将免疫磁珠技术与双重PCR技术相结合检测 LM，极大程度地提高了检测特异性，降低了检测结果中出现假阳性的概率，不仅为下一步的筛选工作减少时间，也降低了工作量。Wang等[31]将纳米免疫磁分离技术与量子点荧光分析相结合，可实现2 h内同时靶向检测食物样品中的单增李斯特氏菌、大肠埃希氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，在样品中检测限为20 CFU/mL～50 CFU/mL。Garrido[32]等将实时重组酶聚合酶扩增和免疫磁性分离结合并成功应用于检测50份烟熏三文鱼样品，预富集24 h后，检测到2×102-9.3×102CFU/25 g 单增李斯特氏菌，检测结果有了很大的提高，该方法检测限为6.3 CFU/25 g，灵敏度、特异性和准确度相比于其他RPA方法更高。

4 生物传感器

生物传感器是由生物识别和信号转换两种元件组成，通过检测目标化合物输出的电和光信号，以此进行分析检测。根据生物传感器的信号转换器不同，可以将其分为电化学式生物传感器、光学式生物传感器等。生物传感器这种方法可快速完成检测，有的甚至只需几个小时就可完成并且操作简单。但是在实际应用中该技术读取荧光时需使用大型仪器，不便捷且对实验的环境要求比较高[33，34]。黄闪闪[35]制备了两种传感器分别为以道诺霉素为杂交指示剂和无需指示剂的电化学生物传感器。检出限达3.78×10-14moL/L，敏感度较高，且具良好的特异性、稳定性与重现性。程超男[36]将免疫分析与电化学技术结合构建了基于夹心法模式的计时电流法电化学免疫传感器，用于快速灵敏地检测单增李斯特氏菌。在优化的条件下定量检测结果表明检测限为102CFU/mL，检测时间只需200 s且无交叉反应。应用于对牛奶中LM检测结果得出范围在103CFU/mL～106CFU/mL且不需要对样品进行前处理可以直接检测。Wang[37]等建立了一种基于PCR的一步通用生物传感器，利用动态光散射(DLS)技术检测核酸和蛋白质的大小。该传感系统采用DNA修饰的AuNPs(AuNPs DNA)探针作为TaqMan信号探针，该策略可实现目标双链DNA(ds DNA)的序列特异性识别，克服PCR周期增加引起的背景信号变化。进一步证明了其在检测食源性病原体单增李斯特氏菌的适用性，检测限为1.2 fg/μL，比比色法更灵敏。

5 代谢组学技术

代谢组学是研究微生物代谢产物动态变化的规律，应用较广泛的是ATP生物发光检测技术。利用的是由于活菌内含有ATP ，当细菌死亡后ATP被细胞内的酶分解，通过荧光素酶和荧光素可以使其释放能量并产生荧光信号，因此荧光信号的量与ATP 浓度成线性关系[38]。活菌总数通过ATP 的浓度测定即可推算出。该法操作简单，不需要培养样本中的微生物，灵敏度高，可用于检测食物中LM，但是易受温度、酸碱、食品中基质等条件影响，该法无特异性。

6 展望

传统的单增李斯特氏菌检测技术所需要的检测成本少，而且对操作人员的要求不像分子学方法一样高，不足之处是耗费时间浪费人力，对一些不可培养或者较难培养的致病菌无法完成检测，检测过程往往耗时较长需几天才能完成，无法实现对结果有效的监控和预防。分子生物学技术虽然具有高敏感性、高特异性的特点，但是对检测人员的操作要求高，预处理较复杂，需要的相关试剂和设备价格高昂，主要用于实验室分析且不适合现场检测。目前应用最多的是实时荧光定量PCR以及LAMP，市场上也有相应试剂盒，检测更为方便快捷，可对样品进行定量。免疫学测定方法，简单快捷，尤其是免疫层析试纸条携带非常方便，很适合进行现场的快速检测，但易受其他杂菌干扰，灵敏度不够高。免疫磁分离技术也逐渐发展起来，利用其作为样品预处理进行增菌并与其他分子免疫学方法联合应用可极大地提高灵敏度。以免疫学和核酸分析为基础的生物传感器检测技术也逐渐运用到检测致病菌中，而且不需要对样品预增菌处理，但是制备传感器复杂而且较难推广开。以上这些技术虽然目前还存在很多不足，但是随着科学技术的不断更新发展会得到进一步的完善和改进措施，特别是近年来不同学科之间的相互渗透日益加强，不同方法之间的结合使用也会成为未来食源性单增李斯特氏菌检测的发展前景。