奶牛乳房炎诊断方法研究进展

王豪杰，李旭妮，彭小兵，冯 妍，张 贺，朱良全

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

乳制品已成为人民日常生活不可或缺的主要食品，其产业发展与奶牛养殖业密不可分。奶牛乳房炎(bovine mastitis，BM)是严重危害奶牛养殖业的重要疾病之一[1]，其诊断技术水平直接反映国家畜牧业发展水平和科技实力。本文主要论述了不同诊断方法的优缺点，并思考了如何将诊断技术更好地应用于实际生产中，以期为防治该病和开发诊断新技术提供参考。

1 奶牛乳房炎概况

1.1 流行现状及危害

奶牛乳房炎又称奶牛乳腺炎，是乳腺受到物理、化学、致病微生物以及其他因素所引起的一种炎性变化，主要表现为乳汁理化性质改变、体细胞数变化以及乳腺组织病理学变化。据报道，全世界每年因乳房炎经济损失达350亿美元，仅美国奶业损失每年可达20多亿美元，在我国奶牛乳房炎发病率约为46%～70%[2]。其危害主要体现在以下几方面：(1)可致泌乳量降低10%～15%及乳质量变差，治疗不当可致终身不产乳[3]。(2)影响繁殖性能且导致奶牛淘汰率达9%～10%[4]。(3)病牛乳汁含有非乳源性杂质或治疗的抗生素等药物残留，影响食品安全。

1.2 分类及发病机制

根据乳汁肉眼可见变化，可分为临床型乳房炎(clinical mastitis，CM)、隐性乳房炎(subclinical mastitis，SM)和慢性乳房炎。根据发病特点和病理变化又分为浆液性乳房炎、卡他性乳房炎、纤维蛋性乳房炎、出血性乳房炎、化脓性乳房炎、坏疸性乳房炎。

乳房炎发生主要包括3个时期[5]：(1)因各种不良因素，致使病原菌从乳头口入侵乳头管；(2)病原菌侵入乳腺组织后，在乳房内繁殖进而导致重复感染；(3)乳腺组织发生炎症反应。

2 奶牛乳房炎诊断技术

2.1 病原菌分离

病原菌分离常被认为是传统诊断的“金标准”，分离培养出的病原菌对于抗生素选择使用有许多优势。但该方法对隐性乳房炎鉴定准确性低、耗时长、变异性较大，易出现假阴性。

2.2 体细胞计数法

体细胞计数法有直接和间接计数法两种。直接计数法主要用仪器进行测定，如利拉伐细胞计数器、Fossomatic 细胞计数器等简单准确，可自动地分析大量样本。但花费高，使用不普遍。

间接计数法主要是破坏乳汁中体细胞，使其释放核酸物质，进一步反应会产生沉淀或凝胶。研究表明，乳汁体细胞数低于2×105个/mL为阴性，在2×105个/mL～5×105个/mL之间为可疑，大于或等于5×105个/mL则判定为隐性乳房炎[6]。基于此原理，常用的有美国加州乳房炎诊断试剂(CMT)，但其准确度(87.4%～90.8%)较低。在我国也有兰州(LMT)、北京(BMT)和杭州(HMT)等诊断试剂。该方法较为费力且不适合初乳期和泌乳后期，在大型奶牛场中可作为辅助诊断。

2.3 分子生物学诊断

分子生物学技术包括聚合酶链式反应(PCR)、环介导的等温扩增(LAMP)和多重实时PCR等，可检测引起亚临床乳房炎的病原体或其遗传物质。PCR一般以16S～23S rRNA间隔保守区为扩增序列。希尼尼根等[7]建立了可同时检测金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、牛支原体的多重PCR方法，该方法敏感性分别为10 pg/μL、1 pg/μL和10 pg/μL。

LAMP具有钙黄绿素介导的量热无线检测系统，可在65 min内有效检测病原体，更适用于金黄色葡萄球菌快速检测[8]。Kawai等[9]选择引起乳房炎的12个属的病原微生物，利用32个引物以及能同时检测所有病原的DNA芯片，通过LAMP优化DNA扩增条件，与细菌培养结果相比，当培养法设置为100%时，DNA芯片的总阳性率为85.0%，总阴性率为86.9%，此方法可快速准确检测到乳房炎的病原。

多重实时荧光定量PCR是传统PCR的改进，利用荧光信号积累对扩增的DNA进行实时监测。张莉莉等[10]针对大肠埃希氏菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的保守序列设计合成了3套特异性引物,通过优化PCR反应体系和反应条件,建立的多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,最低检测浓度分别为102、103、104拷贝数/μL,敏感性较高，DNA各个拷贝数浓度变异系数均低于2.02%，重复性良好，具有良好的推广应用价值。与传统培养方法相比，PCR诊断技术特异性强、敏感性高、操作方便、耗时短且误差小。

2.4 生物物理技术诊断

电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)和红外热成像(IRT)均能显著促进乳腺炎相关病原菌的鉴定，允许从物种水平对细菌进行准确鉴定。Magro等[11]研究，基于质谱原理的MALDI-TOFMS可在极短时间内测定细菌种类或其蛋白质。该技术特异性强和灵敏度高，能替代或补充通过表型方法进行鉴定，但仅适用于现有细菌蛋白质谱的特定光谱数据库，如广泛使用不太经济。

傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术基于对全生物体DNA鉴定，通过被测物种的光谱与参考数据库中已知物种的光谱进行比对，可在亚种或品系水平上区分乳房炎病原体生物，分别使用FTIR和MALDI-TOF MS方法鉴定牛乳腺炎相关的革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性球菌，其正确率分别为100%和90.5%，前者略优于质谱法[12-13]。

红外热成像(IRT)基于皮肤或乳房表面的热或温差，以图像形式反映。其高灵敏度热感相机可检测乳房表面温度的微小变化或炎症，通过移动信息技术应用，可以成为一个便携式诊断工具[14]，其敏感性和特异性分别为95.6%和93.6%[15]。其敏感性和特异性虽然很高，但在实际操作中难度大，有待进一步研究。

2.5 基于传感器的乳房炎诊断

在诊断领域，监测奶牛乳房炎发病时或发病前行为变化极其重要。奶牛在采食量和整体活动方面变化显著，这些疾病迹象在临床症状出现前几天就很明显，因此可作为监测指标。Chinnappan等[16]基于磁性纳米颗粒，通过使用纤溶酶的蛋白水解活性作为生物标记，开发了一种特异性检测金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌的比色生物传感器，其灵敏度在体外测定为1 ng/mL纤溶酶。该方法能区分健康乳和病乳，且在乳房炎诊断过程中反应迅速、简单、灵敏、潜力大，可用作初始诊断。

2.6 蛋白质组学分析

蛋白质组学方法在诊断、预测和预防奶牛乳房炎以及标准化质量方面非常有用。这种方法有助于鉴定乳房内感染(IMI)生物标志物[17-19]。研究表明，N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)就是一种重要的BM炎症标志物，基于此可对全乳复杂基质进行分析[20]。一些组合策略液已被用于奶牛乳房炎期间牛奶的蛋白质组分析，如双向凝胶电泳后的MALDI-TOFMS(2D-GE)，液相色谱和串联质谱的联合应用。Abdelmegid等[17]采用二维差异凝胶电泳(2D-DIGE )结合液相色谱和串联质谱技术，从具有肥大症状的病乳中检测到28种高丰度蛋白，其中9种具有宿主防御功能，这些蛋白包括参与先天免疫和抗菌功能的急性期蛋白以及与病原体免疫反应相关的蛋白，可成为奶牛隐性乳房炎潜在的候选生物标志物。

2.7 特异性免疫分析

根据抗原抗体反应特性，免疫检测成为诊断亚临床乳腺炎的有效方法，如乳胶凝集法、免疫层析法[21]。Jaeger等[22]利用牛乳淀粉样蛋白A作为检测亚临床乳房炎的生物标志物，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)进行了检测，其结果对主要病原体检测灵敏度为81.4%、特异性为93.4%，对全病原体检测灵敏度为88.0%、特异性为65.2%。与常规酶联免疫吸附试验相比，基于磁珠的酶联免疫吸附试验具有快速、操作简单、检测试剂少的优势。但可能存在由于交叉反应导致非特异性高缺点。此外，成本较高，对基础设施和人员技术熟练的要求高。

2.8 基因测序分析

基因分型、指纹识别已经成为一种重要的奶牛乳房炎诊断工具，不仅用于微生物的种、亚种、菌株水平鉴定，还用于流行病学研究。核糖分型、脉冲场凝胶电泳(PFGE)，扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态DNA(RAPD)和多位点序列分型(MLST)经常被用于基因分型[23,24]。Pumipuntu等[25]使用PFGE和MLST进行金黄色葡萄球菌引起牛乳房炎的各菌株基因分型鉴定，发现凝固酶阳性分离株具有11 种不同的PFGE模式和一种不可分型模式，其中个别模式与多位点ST无关，在金黄色葡萄球菌中发现了3个新的ST隔离。陈婷婷等[26]利用多位点序列分型(MLST)对甘肃部分地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌进行了检测，发现26株金黄色葡萄球菌中存在9种ST序列型，其中ST59为优势序列型。本方法具有方便、准确的特点，但因其成本昂贵、耗时长，现阶段难以投入临床使用。

3 奶牛乳房炎诊断在防治中应用的思考

3.1 早期快速准确诊断是做好防治工作的重要前提

奶牛乳房炎因素多，涉及病原广，以分子生物学及免疫学技术为基础，开发现场快速及实验室高通量快速准确诊断技术将是未来发展趋势，如多病原基因芯片或蛋白芯片技术，基因组、蛋白质组及代谢组学技术。此外，智能化、信息化技术结合也是诊断领域研发热点，如生物传感器技术有望成为检测奶牛乳腺炎的重要工具。各方法优缺点不同，单一应用无法达到理想目标。因此，多种方法联合应用可更准确的防治，如以PCR检测为主，体细胞计数法检测相结合的应用。

3.2 特征性生理指标及代谢产物等检测技术开发是做好防治工作的重要支撑

隐性乳房炎系诊断领域重要课题。及时监测奶牛采食量及整体活动方面的变化，如用IRT技术监测奶牛乳房表面温度，再通过检测乳汁中一些酶活性物质的活性或代谢产生的微量元素来客观评估乳房炎的病程情况，为实施综合治疗方案提供支撑。

3.3 简便、快捷的适用技术广泛推广是临床诊断的迫切要求

不同规模的养殖场应采取相适应的检测技术，在大型规模化养殖场中，奶牛数量多，若用常规检测，则费时费力，贻误病情。应利用数字化、信息化、人工智能等相关技术使用传感器数据来改善乳房炎管理的新方法。在小型养殖场中，饲养及相关兽医技术人员层次不齐，开发类似乳汁电导率检测、乳汁pH测定、乳清中蛋白含量测定以及现场荧光定量PCR、试纸条、LAMP等简便、适用技术，是进行快速推广和实现及时快速处置的有效手段。