表皮生长因子受体Ⅲ型突变体在胶质瘤中的研究进展△

郭奕卓，刘芳

1大连医科大学研究生院，辽宁 大连 116044

2南京医科大学附属常州第二人民医院神经外科，江苏 常州 213000

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，多呈浸润性生长，手术难以完全切除，放化疗效果不理想且易复发，患者的中位生存期仅为15个月。与其他肿瘤一样，胶质瘤的发生发展是一个多基因参与、多步骤演变的复杂过程[1]。研究显示，40%～50%的胶质瘤患者存在表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）异常表达，原发性胶质瘤中除伴有不同程度的EGFR过表达外，约1/3还存在EGFR突变[2]，其中，最常见的突变形式是表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（epidermal growth factor receptor variantⅢ，EGFRvⅢ），占25%～64%[3-4]。目前，EGFR过表达、突变与非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌等多种肿瘤细胞的增殖、分化、转移等过程密切相关，但对于EGFR、EGFRvⅢ与胶质瘤间关系的研究较少，本文对近年来EGFRvⅢ在胶质瘤中表达及与患者治疗、预后间的关系进行综述。

1 EGFR与EGFRvⅢ的关系

EGFR是受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）家族成员，普遍表达于人体表皮细胞和基质细胞[5]，由3个功能区组成，分别为胞外配体连接区、单链跨膜区和胞内酪氨酸激酶区[6]。在细胞存活、增殖、代谢、侵袭、转移、血管生成等细胞内信号通路中发挥着至关重要的作用[7-8]。Downward等[8]研究发现，人类EGFR与v-erbB间高度同源，Schechter等[9]从乙基亚硝基脲诱导的大鼠神经母细胞瘤中分离出NEU基因，发现NEU是一个大鼠erbB-2基因，可在跨膜结构域中单点突变。上述两项研究为EGFR异常表达导致胶质瘤发生的分子机制提供了有价值的参考。EGFRvⅢ属于EGFR胞外区框内缺失性突变，其胞外的2～7号外显子缺失，导致801对碱基缺失，使外显子1和8相连并融合产生一个新的氨基酸——甘氨酸，这也为胶质瘤靶向治疗提供了一个重要靶点，即利用EGFRvⅢ单抗来特异性识别胶质瘤细胞[10]，后文也将对此进行详细介绍。EGFRvⅢ失去了连接配体的功能，但却可在不依赖配体的情况下参与肿瘤的发生发展过程，同时，EGFRvⅢ还可以缩小黏着斑的大小并减少其数量，增强肿瘤细胞的迁移能力。还有研究发现，EGFRvⅢ的内在信号可以通过细胞因子串联传播到野生型EGFR细胞，从而进一步导致黏附减少和迁移增加[11]。

2 EGFRv Ⅲ在胶质瘤中的表达

Werner等[12]采用免疫组化法发现，健康者星形细胞中检测不到EGFR的表达，但在胶质瘤中表达明显上调。Reifenberger等[13]报道显示，EGFR在低级别胶质瘤[世界卫生组织（WHO）分级为Ⅰ、Ⅱ级]中的表达率为9%，而在高级别胶质瘤（WHO分级为Ⅲ、Ⅳ级）中为79%；EGFR在低级别星形细胞瘤（Ⅱ级）、间变性星形细胞瘤（Ⅲ级）、胶质母细胞瘤（Ⅳ级）中表达率分别为67%、87%和100%，提示EGFR的表达在星形细胞瘤和胶质母细胞瘤发生发展过程中可能发挥着重要作用。呼铁民和孙影[14]利用免疫印迹法研究证实，EGFR蛋白的表达与胶质瘤的恶性程度呈正相关。

EGFR表达的同时往往伴随其突变，但这是一个容易被低估的潜在因素。对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库分析结果显示，EGFR在低级别胶质瘤中突变率为23%，其中EGFRvⅢ约占24%，虽然这可能归因于不同患者群体和更深的测序深度，但这或许能够解释某些快速进展的低级别胶质瘤（由组织病理学诊断）的潜在发病机制，即这些胶质瘤本质上可能是分子水平上的高级别胶质瘤。一项纳入117例胶质瘤患者的研究发现，51%的胶质母细胞瘤、23%的星形细胞瘤和31%的间变性少突胶质细胞瘤患者中EGFRvⅢ呈阳性，该团队的早期试验也曾发现，在所有级别的胶质瘤中，近34.5%的肿瘤细胞存在EGFRvⅢ，这足以使临床重点关注EGFRvⅢ在胶质瘤治疗中的作用[4]。

3 EGFRvⅢ与胶质瘤免疫治疗

3.1 单克隆抗体

目前，肿瘤的分子靶向治疗不断发展，其使用价值已被广泛认可，其主要通过药物阻断肿瘤发生发展的下游信号通路，进而抑制机体对正常细胞的杀伤作用，控制肿瘤进展，延长患者的生存期[11]。目前，EGFRvⅢ单抗类靶向药物主要包括西妥昔单抗、贝伐珠单抗等。Jutten等[15]的研究表明，西妥昔单抗可与EGFRvⅢ结合，导致EGFRvⅢ初始激活、内化和继发性下调。一项研究探讨Rindopepimut联合贝伐珠单抗治疗的复发性EGFRvⅢ阳性胶质母细胞瘤的随机、双盲、Ⅱ期临床试验，入组条件包括组织学确诊的原发或复发胶质母细胞瘤、聚合酶链反应证实EGFRvⅢ阳性且未接受过贝伐珠单抗或其他血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）抑制剂治疗，结果共入组73例胶质母细胞瘤患者，其中36例治疗组患者接受Rindopepimut+贝伐珠单抗治疗，37例对照组患者接受钥孔血蓝蛋白+贝伐珠单抗治疗，通过定期MRI检查评估肿瘤对治疗的反应及进展情况，以6个月无进展生存率为主要研究终点，结果显示，治疗组与对照组患者的6个月无进展生存率分别为28%和16%，而作为次要终点的总生存率也是治疗组显著较高（HR=0.53，95%CI：0.32～0.88，P=0.01），客观缓解率（objective response rate，ORR）分别为30%和18%，治疗组患者的抗EGFRvⅢ抗体滴度较基线明显升高[16]，表明贝伐珠单抗联合Rindopepimut对EGFRvⅢ阳性胶质母细胞瘤患者有一定的治疗价值。

3.2 肿瘤疫苗

抗肿瘤治疗的抗体既可以是单克隆抗体，也可以是抗原刺激诱导产生的内源性抗体，即主动免疫治疗。大多数表征良好的肿瘤抗原是过表达的正常蛋白，在一定程度上触发了机体的免疫耐受，若有效地靶向此类过表达的蛋白，可损害其抗肿瘤排斥抗原的有效性，并带来自身免疫风险[17]，但EGFRvⅢ这一框内缺失突变可使密码子分裂，在融合连接处产生新的甘氨酸，从而产生在任何健康成年患者组织中均未发现的肿瘤特异性表位[18]。Heimberger和Sampson[19]研究证实，在同基因鼠模型中接种针对EGFRvⅢ的PEP-3-KLH（CDX-110）疫苗是一种有效的免疫治疗方法，随即开展的临床试验将PEP-3-KLH加载到自体树突状细胞中进行接种，未进行EGFRvⅢ检测患者的总生存期（overall survival，OS）为22.8个月，通过EGFRvⅢ阳性筛选患者的OS为26个月。一项PEP-3-KLH疫苗联合替莫唑胺化疗治疗胶质母细胞瘤患者的临床试验中，患者的中位OS达到33个月[19]。这项研究虽然结果令人惊喜，但EGFRvⅢ的肿瘤疫苗研究之路仍然漫长，如针对EGFRvⅢ的组织相容性复合体的辅助表位尚未得到验证，进而导致不能精准制备四聚体。

3.3 T细胞疗法

胶质瘤的免疫治疗除主动和被动免疫外，基于T细胞的过继细胞转移（adoptive cell transfer，ACT）疗法，是从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，于体外进行功能鉴定并扩增，然后回输患者体内，从而直接杀伤肿瘤细胞或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞，是近年来的研究热点[19-20]。目前，嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）T细胞疗法已被证实对血液系统恶性肿瘤有效，但在实体瘤特别是胶质瘤中的应用仍处于早期阶段[3]。对于成功的CAR-T定向治疗，理想的靶标应均匀地出现在肿瘤细胞表面，而不表达于正常组织中，靶向EGFRvⅢ的CAR-T细胞能够抑制体外和表达该变异体小鼠颅内肿瘤细胞的生长。基于众多临床前研究，Goff等[3]进行了一项先导性临床试验，结果显示，靶向EGFRvⅢ的自体CAR-T细胞ACT疗法并不能缓解胶质瘤进展，且在延长患者生存期方面暂时没有明显成果。由于CAR靶标仅局限于细胞表面表达的抗原，因此，大量来源于细胞内蛋白的肿瘤特异性新抗原推动了基于T细胞受体（T cell receptor，TCR）疗法的发展，有研究发现了一个限制性表位，并从中克隆了可转导至TCR的α-链和β-链的互补DNA（complementary DNA，cDNA），这种特异的TCR-T细胞可以在体外以抗原和人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）特异性的方式有效杀死对应的胶质瘤细胞[21]。此外，当用于ACT研究时，这些TCR-T细胞还抑制了小鼠颅内神经胶质瘤异种移植的进展[22]。但目前尚无针对EGFRvⅢ突变的TCR-T细胞的体外或动物模型实验，且由于TCR-T在患者中的有效性可能还需要保证HLA的表达，但基于EGFRvⅢ表达产生的特殊结构，这种方法未来仍有可能会是研究热点。肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）可能是胶质瘤患者T细胞的可行来源[21，23-24]，Brennan等[25]描述了稳定扩增TIL的方法，该TIL可与自体胶质瘤细胞发生反应：首先进行肿瘤DNA外显子组测序，并随后对TIL定义的肿瘤相关靶标进行分析，该研究使用自体建立的肿瘤细胞系测试肿瘤细胞，仍需将病灶中肿瘤细胞的多样性考虑其中。相关研究表明，EGFRvⅢ阳性胶质瘤患者胶质瘤组织中CD8+TIL浸润程度明显上升[26]，因此，分离EGFRvⅢ阳性胶质瘤患者中的CD8+TIL、行体外扩增和体外杀伤实验可能成为今后的研究方向。

4 EGFRv Ⅲ与胶质瘤患者预后的关系

多数学者认为，EGFRvⅢ表达与胶质瘤患者的预后不良相关。但Heimberger和Sampson[19]认为，EGFR/EGFRvⅢ不能独立预测胶质母细胞瘤患者的OS，但对于OS超过1年的患者，EGFRvⅢ的表达是一个独立且显著的负性预后指标。也有研究提示，EGFRvⅢ扩增与患者的预后无关[27]。Pelloski等[28]指出，标准预后因素不能预测EGFRvⅢ阳性胶质母细胞瘤患者的预后，这也可能与部分学者对EGFRvⅢ表达对胶质瘤患者预后的影响持不同意见有关。

已有研究表明，在新诊断和复发胶质瘤患者的肿瘤组织中均发现了CD4+TIL、CD8+TIL等，且TIL的数量被证实与胶质瘤患者的预后呈正相关[23]。某些基因突变会影响胶质瘤组织中免疫细胞的浸润程度，Hao和Guo[1]研究显示，EGFRvⅢ低级别胶质瘤患者中CD8+TIL、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的浸润程度更高，患者的预后更差，并因此提出了新的潜在预测预后和免疫微环境的标志物，为评估EGFRvⅢ低级别胶质瘤患者的预后提供了新思路。

5 小结与展望

自1984年Libermann等首次报道EGFR在脑胶质瘤中过表达以来，多数学者对胶质瘤中EGFR的表达情况及与胶质瘤发生发展、治疗的关系进行了研究。EGFR的表达促进了胶质瘤的发生发展，EGFR过表达和突变情况决定着胶质瘤的恶性程度，并直接影响患者对放疗的敏感性。目前，针对EGFRvⅢ的多种胶质瘤免疫治疗在临床前研究有所进展，其在临床应用研究中仍任重道远，但关于贝伐珠单抗联合Rindopepimut、PEP-3-KLH疫苗等研究所取得的成果为胶质瘤的治疗带来了希望，同时，EGFRvⅢ阳性患者的ACT疗法可能成为未来胶质瘤免疫治疗的研究热点。EGFRvⅢ的表达与胶质瘤患者的不良预后显著相关，对于那些不一致的研究结果，可能与检测方法、操作手法、临床资料完整性等有关，也间接说明了胶质瘤异质性、治疗困难等特点。因此，需要进行多中心、大样本的研究去阐明EGFRvⅢ对胶质瘤患者预后的预测价值，这也可能成为未来主要的努力方向。