大疱性表皮松解症及其分子治疗研究进展

李杏杏，孔姝敏，曹育春，孙小燕

（华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科，湖北 武汉 430030）

大疱性表皮松解症（Epidermolysis bullosa，EB）一般指遗传性大疱性表皮松解症，是一种以常染色体显性或隐性方式遗传的皮肤病。EB的临床特点是轻微创伤或摩擦后皮肤黏膜即可出现水疱、糜烂或溃疡［1，2］。大多数EB患者可伴发瘙痒，不同亚型之间瘙痒发生率存在显著差异［3］。EB的临床表现并不局限于皮肤和黏膜，常伴有全身并发症，包括营养不良、微量元素缺乏、贫血、慢性炎症、感染、继发皮肤鳞癌等［4］。本文大致概述了EB的分子病理学机制、临床分型和基因突变特点，主要阐述了基因治疗、细胞疗法、蛋白质疗法和小分子药物治疗等EB最新的分子治疗进展。

1 EB的分子病理学机制

皮肤是人体最大的器官，由皮下组织、真皮及覆盖在上的表皮层组成。表皮基底层和真皮乳头层之间由细胞外基质大分子物质将表皮与真皮紧密连接，称基底膜带（basement membrane zone，BMZ）。BMZ不仅提供了细胞黏附的支架，还为细胞迁移提供了条件，为细胞和分子提供了选择性通透屏障，可调节被覆上皮细胞的分化、发育和死亡。电镜下BMZ由浅至深为胞膜层、透明层、致密层及致密下层，这个区域是EB病理生理中心位置。在胞膜层，半桥粒借助附着斑与胞质内张力细丝相连，同时通过多种跨膜蛋白如BPAG2、整合素α6β4等与下方透明层黏附，起“铆钉”样作用。在下方，锚丝、Ⅳ型胶原、Ⅶ型胶原即锚原纤维相互交联，具有连接和固定作用，是BMZ重要支撑结构［5］。EB的临床表现取决于特定基因的分子畸变及影响皮肤黏膜脆性超微结构的异常平面位置。目前已发现19个基因的致病变异与EB相关，包 括COL17A、KRT5、KRT14、LAMA3、LAMB3、LAMC2、ITGB4、ITGA3等［6，7］。这些基因编码突变影响上述结构的相应功能及稳定表达，导致皮肤脆性增加，引起EB的典型临床表现。上述受影响基因和蛋白种类及其致病遗传变异的具体性质一定程度上决定了EB的表型。具体来说，受影响蛋白残余量或残余功能多少，决定了疾病严重程度是轻度、中度还是重度［8，9］。

2 EB的主要临床亚型

根据超微结构中结构脆性和水疱形成的平面位置不同，EB可分为如下四种类型，而各类型又可分为不同的亚型，有不同的遗传方式和致病分子。

2.1 单纯型大疱性表皮松解症（Epidermolysis Bullosa simplex，EBS） EBS是EB中最常见的类型，多为常染色体显性遗传，也有一些罕见的常染色体隐性遗传。该型临床表现较轻，偶有重度泛发性EBS的病例报道［10］。大多数EBS是由编码角蛋白5和角蛋白14的KRT5或KRT14基因显性突变引起的。该突变导致基底层角质形成细胞的中间角蛋白丝网络缺陷，引起表皮内的分裂［11，12］。EBS患者的发病年龄不定，其皮损如糜烂和水疱等愈合后基本不遗留疤痕，皮肤症状大多随着年龄的增长而改善。而重度泛发性EBS经常伴随出现疼痛性掌跖角化病和甲营养不良［4］。

2.2 营养不良型大疱性表皮松解症（Dystrophic Epidermolysis Bullosa，DEB） DEB是EB中第二常见的类型，为常染色体显性或隐性遗传。DEB是由于COL7A1基因突变，无法正常编码VII型胶原（C7），在基底膜致密下层发生相应病变［15］。DEB临床表现具有广泛变异性，无论是自发或轻微创伤均可引起表皮脱落、水疱和粟丘疹形成。所有粘膜包括口腔，食管，眼部，生殖器，肛门等，均可受到影响，并伴有全身并发症。瘙痒是DEB的一个主要并发症，在即将愈合的皮损处尤甚，由此引起的搔抓是一个重要的加重病情的行为因素。其中，隐性遗传型DEB（RDEB）能够导致严重的局部或全身并发症。局部并发症包括慢性复发性皮损处伤口、假性并指、食管狭窄、结膜溃疡、疼痛性角膜糜烂和睑球粘连等。全身性并发症包括营养不良、贫血、全身性感染、肾淀粉样变性和骨质疏松等。其他DEB亚型包括中间型、反相型、局限性、痒疹型等，症状相比而言较轻［1］。慢性创面进展为侵袭性皮肤癌如皮肤鳞状细胞癌是DEB患者死亡的主要原因，有数据认为超过50%的DEB患者在40岁之前死于转移性鳞状细胞癌［16］。

2.3 交界型大疱性表皮松解症（Junctional Epidermolysis Bullosa，JEB） JEB据报道是EB中最少见的类型［10］，主要为常染色体隐性遗传，显性遗传较为罕见。突变涉及半桥粒组成成分的编码基因，如层粘连蛋白332、XVII型胶原、整合素α6β4和整合素α3β1［13］。JEB包含两个主要亚型，即重度型和中度型，两者的疾病严重程度有相当大的差异。重度型JEB临床特征表现为皮肤和粘膜多发广泛性大疱性脱落，常累及呼吸道，婴幼儿患者早期死亡率较高。中度JEB皮肤黏膜受累程度较轻，对预期寿命影响不大，常伴随甲营养不良或甲缺失伴甲周水疱［4，14］。

2.4 Kindler大疱性表皮松解症（Kindler Epidermolysis Bullosa，KEB） KEB以前被称为Kindler综合征，最近被归类为EB的新亚型。kindlin是一类参与构成基底层角质形成细胞接触中心的蛋白，KEB与编码该蛋白的FERMT1基因隐性突变有关。该型分裂水平多重，可以发生在角质形成细胞内，也可以在致密层或致密层以下，且与基底层角质形成细胞的复制异常有关。患者临床表现包括皮肤脆性增加、大疱、光敏、进行性皮肤异色症、明显皮肤萎缩和牙周病等［17］。

3 EB的分子治疗

EB分子治疗在过去几十年里不断发展，已经开展了大量的临床前研究［18，19］。目前大多数治疗方法都旨在通过基因、细胞治疗或蛋白质替代疗法来恢复缺陷结构蛋白的功能。但EB并不局限于皮肤损害，恢复皮肤蛋白功能的治疗可能无法解决EB相关的所有局部和全身并发症。因此，如皮肤炎症、纤维化、瘙痒、疼痛或癌症的治疗方法也正在研究当中。

3.1 细胞疗法 间充质干细胞是一种多能性间充质细胞，可分化为多种细胞类型，包括成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞和成纤维细胞。其具有抗炎、血管生成、抗纤维化和组织修复等特性，有助于改善EB的伤口愈合。Palison［20］团队在智利开展了一项临床研究，即对两名重型泛发性RDEB成年患者皮损内注射健康同种异体骨髓基质干细胞，治疗慢性皮肤溃疡。与一般药物相比，实验组皮损的临床改善持续时间长达4个月，局部炎症减少，伤口愈合更快。

成纤维细胞由于能够产生C7并具有免疫调节特性，易于培养，已成为RDEB细胞治疗研究新方向［21，22］。早期临床前研究表明，皮内注射正常的人类成纤维细胞或基因修正后的RDEB成纤维细胞到免疫缺陷小鼠皮肤，有助于C7的重新表达及锚原纤维的再形成，并促进注射部位的伤口愈合［23-25］。McGrath及其同事［26］在5例RDEB患者皮肤内注射同种异体健康人成纤维细胞，其临床试验结果显示，注射后2周和3个月时测得真皮表皮连接处C7表达增加，伤口愈合改善。

3.2 基因替代疗法 1998年，Dellambra等［27］人证明了可以使用携带LAMB3 cDNA的经典逆转录病毒载体对JEB角质形成细胞进行体内校正。同样，Goto［22］和Siprashvili［28］等人使用经典逆转录病毒载体将转基因导入体外培养的JEB角质形成细胞，随后将矫正后的细胞移植到免疫缺陷小鼠上，结果显示有锚原纤维形成。之后，不少研究证明将基因矫正后的患者上皮移植回缺陷皮肤后，其皮损处有锚原纤维的重新形成，实现了一定程度的功能矫正［29，30］。这些临床前研究已初步证明了体外基因治疗的潜力。在这些试点研究之后，Holostem发起了两项I/II期临床试验，即对12名携带COL17A1突变的JEB患者（NCT03490331）和12名RDEB患者（NCT02984085）移植基因矫正上皮，评估疗效。

另一种方式是将cDNA通过嗜表皮性HSV或非病毒载体直接传递到皮肤中。例如，Krystal在4例RDEB患者中进行了一项II期试验（NCT03536143），将含有HSV-1载体和强CMV启动子表达的COL7A1 cDNA直接转染到皮肤细胞。这种体内基因治疗耐受良好，重复给药不会引起局部炎症，且最终数据显示，在第8至12周期间，患者伤口面积显著减少，愈合能力增强。

3.3 基因编辑疗法 除了基因替代疗法，一些研究还试图进行基因修复，如通过CRISPR/Cas9基因编辑技术校正突变［31-35］。CRISPR/Cas9以特定的方式诱导DNA双链断裂，通过同源定向修复、非同源末端连接或DNA修复，纠正疾病相关基因突变［36］。既往研究中，来自RDEB患者的角质形成细胞或成纤维细胞通过该技术获得了高产量的基因修正，随后对免疫缺陷小鼠进行皮肤移植，证明了其具有合成功能性C7的能力。CRISPR/ Cas9基因编辑可以精准、永久性地纠正致病突变，恢复基因的生理表达和功能。但它的潜在限制是需要大量培养细胞来生产移植物，效率较为低下，需要更深入、更成熟的技术研究进行完善和改进［37，38］。

3.4 逆转突变细胞疗法 回复镶嵌现象（Revertant mosaicism，RM）是由于自发性或继发性体细胞突变，通过恢复缺陷蛋白的表达来补偿遗传突变和恢复表型的现象，十分罕见。RM为EB细胞基础治疗提供了一种“自然基因治疗”的可能性。在这种情况下，一些皮肤细胞会自发地将突变逆转为野生基因型，从而形成正常皮肤区域［39，40］。EB中首次发现该现象是在JEB患者中，其角质形成细胞干细胞发生体细胞逆转突变后出现健康皮肤补丁［39］。后来在EBS、RDEB和KEB患者的角质形成细胞中进一步证实了RM的存在［40，41］。Matsumura等［42］人进行了一项临床试验，使用从完整皮肤补丁中提取的退化角质形成细胞自体移植治疗3例严重DEB和不愈合溃疡患者（UMIN：000020734），从非病变皮肤中分离并在体外扩增逆转角质形成细胞，培养自体上皮，然后移植到慢性溃疡上。尽管该现象较为罕见，但该治疗方法能够长期纠正基因缺陷，可能是一种更安全的基因治疗。

3.5 外显子跳跃疗法 外显子跳跃是利用反义寡核苷酸（ASOs）来修饰前信使RNA的剪接，使其不能被正常识别，导致目标突变外显子的切除，从而消除导致疾病的突变。一些临床前研究表明，COL7A1中外显子13、70、73、80或105的跳跃剪接能够导致部分功能蛋白在真皮-表皮连接区重新沉积［43-46］。ASO介导的外显子跳跃疗法可以恢复RDEB皮肤异种移植中C7表达和锚原纤维的形成，其密度与正常皮肤相似［43］。目前，一项将一种包含ASO靶向外显子73的水凝胶QR-313，直接局部应用于DEB创面，用于COL7A1矫正的临床试验（NCT03605069）正在进行中。体内ASO介导外显子跳跃治疗的优点在于它们是非免疫原性的，可以局部或系统给药，并保留基因的生理调节。但其治疗需持续终身，只适用于一部分患者。

3.6 蛋白质疗法 临床前研究表明，局部或静脉注射的重组C7可以沉积在真皮-表皮连接区，并促进伤口愈合［47，48］。系统给药重组C7蛋白除了可以靶向到皮肤中，还可以到达受RDEB影响的皮肤外组织，如胃肠道黏膜和眼角膜并进行修复。重组C7已获得美国FDA的快速药物认证，且正在进行一项I/II期临床试验，评估其安全性和耐受性以及在成人RDEB患者中的临床应用（NCT03752905）。中期数据表明，重组C7在所有患者中均有良好的耐受性，未出现任何严重不良反应，且在28天时三次输注后C7的皮肤沉积呈剂量依赖性增加。

3.7 通读疗法 通读疗法是指使用小分子化合物将其氨基酸取代终止密码子，抑制无义突变，使蛋白质正常合成。庆大霉素等氨基糖苷类药物具有抑制无义突变导致的基因翻译终止的能力，能够恢复全长蛋白质的合成，已成为能够治疗人类遗传疾病的药物制剂。Woodley［49］和Chen［50］的实验使用了来自数个出现无义突变的RDEB患者角质形成细胞和成纤维细胞培养物，实验结果显示氨基糖苷类药物可抑制提前终止密码子，恢复具有功能的全长C7的表达。用庆大霉素治疗3例携带无义突变的JEB患者角质形成细胞后，层粘连蛋白332全链恢复，并在真皮-表皮交界区沉积。目前正在对RDEB（NCT03392909）和JEB（NCT03526159）进行临床研究，测试静脉注射庆大霉素的效果。

3.8 用于缓解症状的小分子疗法 纤维化是RDEB的主要病理表现，其中TGF-β信号是纤维化和疾病严重程度的主要驱动因素［51，52］。氯沙坦是一种血管紧张素II型受体拮抗剂，用于治疗高血压，已被证明可以减少TGF-β的产生。在动物模型中，氯沙坦治疗可显著减少畸形RDEB小鼠爪子的纤维化［53］。此外，Wally等［54，55］及临床试验，表明了对重症EBS患者局部注射白介素-1抑制剂双醋瑞因［56］能促进其伤口愈合，减少水疱形成。一项研究表明3例严重EBS患者接受了磷酸二酯酶-4抑制剂阿普斯特的治疗后，皮损较前明显好转，该抑制剂能够调节炎症介质网络（TNF-α、IL-23、IL-17、IL-10等）。虽然上述治疗并不能纠正EB的遗传缺陷，但它能针对治疗该疾病的临床症状，改善患者的生活质量。

4 结语

总的来说，EB中基因突变引起了相应结构蛋白的破坏，影响组织的完整性和黏附性，产生相应临床症状。现阶段对EB分子病理学和潜在机制更深入的了解及研究为其分子治疗的发展奠定了基础。目前有关EB的体内外基因治疗、蛋白质替换和细胞治疗等正进行各个阶段的临床试验，相信随着这些研究的进一步深入，能为未来EB患者的治疗提供更多更有效、更安全的选择。